Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

Agnieszka Kowalkowska, Natalia Wiśniewska

Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Katedra Cytologii i Embriologii Roślin

e-mail: agnieszka.kowalkowska@biol.ug.edu.pl

Mikroskopia elektronowa staje się coraz bardziej powszechna do opisania powierzchni (SEM – skaningowa mikroskopia elektronowa), ale również do opisania organelli komórkowych czy stopów bądź nanostruktur materiałów (TEM – transmisyjna mikroskopia elektronowa). Zasada powstania obrazów z tych mikroskopów opiera się na wykorzystaniu efektów oddziaływania wiązki elektronów z materią. W poprzednim artykule omówiłyśmy mikroskopię skaningową, zatem teraz skupimy się na transmisyjnej.

Kilka słów o historii powstania. 1931 rok – niemiecki fizyk Ernst Ruska z Instytutu Elektrotechniki Wyższej Szkoły Technicznej w Berlinie konstruuje pierwszy transmisyjny mikroskop elektronowy. Za swój wynalazek 1986 roku otrzymuje nagrodę Nobla z fizyki. Skaningowy mikroskop elektronowy jest młodszym wynalazkiem. Niemiecki fizyk Max Knoll w 1935 roku przedstawia koncepcję takiego mikroskopu i w wyniku zaplanowanego eksperymentu ze zdolnością rozdzielczą do 100 µm uzyskuje pierwszy skaningowy obraz powierzchni próbki. Jaka jest istotna różnica w działaniu między SEM a TEM? W skaningowym, wiązka elektronów skanuje preparat, w transmisyjnym – wiązka jest transmitowana przez preparat. Przejdźmy zatem do opisania transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Jego zasada działania jest podobna do działania mikroskopu świetlnego, jednak przyspieszone elektrony posiadają mniejszą długość fali niż długość fali światła widzialnego, co pozwala na uzyskanie większej rozdzielczości niż w mikroskopii optycznej. Elektrony oddziałują z materią silniej niż fotony, stąd konieczność użycia próżni. Źródłem elektronów w tego typu mikroskopie jest katoda (zazwyczaj jest to włókno wolframowe). Elektrony są następnie przyspieszane przez napięcie między katodą i anodą. Zastosowanie próżni pozwala na to, by elektrony swobodnie poruszały się. Obecność soczewek magnetycznych w dziale elektronowym mikroskopu sprawia, że elektrony są zogniskowane poprzez wykorzystanie pola elektrostatycznego.
Jak powstaje obraz? Wiązka elektronów jest transmitowana przez preparat. Sam preparat musi być bardzo cienki (od 5-100 nm). Zakres ten różni się w zależności od średnicy i składu pierwiastkowego próbki. Na ekranie powstaje obraz, w którym ciemniejsze miejsca to obszary, gdzie elektrony zostały rozproszone.

</p>

Jak przygotować materiał do badań?
<p align=”justify”>Wysoka rozdzielczość i duże powiększenia uzyskiwane w TEM pociągają za sobą wymagania dotyczące przygotowania próbek do badań. Pierwszym etapem jest utrwalenie np. używając aldehydu glutarowego i formaldehydu w buforze kakodylowym bądź fosforanowym. Ważne by pH utrwalacza było zbliżone do pH tkanki. Procedura przygotowania próbki jest czasochłonna i zajmuje 2-3 dni pracy. Po pierwszym utrwaleniu kluczowym etapem jest utrwalanie wtórne, czyli osmowanie, czyli zanurzenie materiału w czterotlenku osmu. Czterotlenek osmu wiąże się z lipidami oraz powoduje kontrastowanie („barwienie”) materiału – zwłaszcza błon biologicznych zawierających wysoką zawartość fosfolipidów. Jako metal ciężki osm jest dobrze widoczny w mikroskopie transmisyjnym. Następnie materiał odwadniania się w roztworach alkoholu lub acetonu o wzrastających stężeniach. Kolejny etap to zatopienie preparatów w żywicy epoksydowej (o wysokiej twardości), a następnie krajanie preparatów na skrawki używając noży szklanych i noża diamentowego w urządzeniach zwanych ultramikrotomami. Do oglądania w mikroskopie transmisyjnym będą odpowiednie skrawki o minimalnej grubości od 20 do 60 nm (stąd ich nazwa – ultracienkie). Takie skrawki nakłada się w precyzyjny sposób na siatki miedziane o średnicy 3 mm, które są odpowiednikiem szkiełka podstawowego w mikroskopii świetlnej. Następnie siatki z preparatami przygotowuje się do oglądania w TEM poprzez utrwalenie octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Ten pierwszy kontrastuje białka i kwasy nukleinowe, ten drugi – lipidy i wielocukry. Etap przygotowania preparatów jest długi i wymaga dokładności oraz staranności wykonania.</p>

Przykładowe zdjęcia – elektronogramy z TEM:

TEM-Fig-2
 Fig. 1. Bulbophyllum wendlandianum, elektronogram przedstawiający wnętrze komórki epidermy warżki; cw= ściana komórkowa, d = diktiosom, m = mitochondrium, mvb = ciało wielopęcherzykowe, ri = rybosom, va = wakuola, ve = pęcherzyki wbudowujące się w plazmalemmę; biała strzałka wskazuje na obecność struktur mielinowych; Fot. A. Kowalkowska i M. Kozieradzka-Kiszkurno.
TEM-Fig-3
 Fig. 2. Kruszczyk błotny (Epipactis palustris), fragment komórki przedstawiający krople lipidową (l) znajdującą się w bezpośrednim kontakcie z dobrze rozwiniętym retikulum entoplazmatycznym ER; strzałka wskazuje strefę kontaktu ER z plasmalemmą (pl); gwiazdki (*) wskazują pęcherzyki wbudowujące się w plazmalemmę; va = wakuola; mvb = ciało wielopęcherzykowe. Fot. A. Kowalkowska i M. Kozieradzka-Kiszkurno.  

 

TEM-Fig-4   
Fig. 3. Epipactis palustris, fragment epidermy zgrubienia występującego na warżce: warstwa kutykuli, w kórej wyrózniamy: kutykulę właśiwą (cp) i kutykulę siatkowatą (cl); gwiazdki (*) wskazują na miejsca, gdzie pęcherzyki wbudowują się w plazmalemmę (pl); cw = ściana komórkowa; va = wakuola; d = diktiosom. Fot. A. Kowalkowska i M. Kozieradzka-Kiszkurno.

 

TEM Fig 4a
TEM Fig 5
[/columns]

Fig. 4, 5. Fiołek wonny (Viola odorata), apatar szparkowy w części wierzchołkowej miodnika. CW= ściana komórkowa, SC= jama podszparkowa, L= kropla lipidowa, M= mitochondrium, Nu= jąderko, S= skrobia. Fot. N. Wiśniewska

TEM Fig 6
Fig. 6. Viola odorata, komórki miękiszu miodnikowego w części wierzchołkowej miodnika. V= wakuola, P= plastyd, M= mitochondrium, N= jądro, RER= retikulum endoplazmatyczne szorskie. Fot. N. Wiśniewska.

Więcej szczegółowych informacji znajdziesz tu:

http://www.ztch.umcs.lublin.pl/materialy/rozdzial_12.pdf

http://labnews.pl/informacje/Transmisyjna-mikroskopia-elektronowa-tem,174

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4287663/pdf/709_2014_Article_668.pdf

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00606-014-1100-2#page-1

 

Print Friendly, PDF & Email

Kategorie: Artykuły biologiczne,Biologia

Pozostaw odpowiedź

pożyczki prywatna od ręki
pożyczka prywatna od ręki u klienta do zl bez bik udzielamy male pozyczki reki wszystko finansujemy sami dojezdzamy na