Jak oczyścić białko? cz. 5

Jedną z szeroko stosowanych metod oczyszczania białek jest chromatografia powinowactwa. Wykorzystuje ona duże podobieństwo białek do niektórych specyficznych grup chemicznych. Podobnie jak w poprzedniej części artykułów z serii oczyszczania białek, również i tu wykorzystuje się kolumnę. Załóżmy, że naszym celem jest wyizolowanie konkawaliny A, jednego z białek roślinnych, które jako mitogen służy do regulacji podziałów komórkowych. Najpierw surowy ekstrakt z komórek roślinnych należy przepuścić przez kolumnę wypełnioną ziarenkami żelu. Granulki te mają tę ważną właściwość, że kowalencyjnie są do nich przyczepione reszty glukozy. Jest to ważne, gdyż konkawalina posiada powinowactwo do tego cukru, co oznacza, że “chętnie” się z nim wiąże. Co ważne, w tym przypadku pozostałe białka (lub większość) w mieszaninie takiej skłonności do przyłączania nie mają. Po związaniu konkawaliny z żelem trzeba następnie, czyli po przesączeniu się całego ekstraktu,  ją od niego odczepić. W tym celu dodaje się stężony roztwór glukozy. Spowoduje to, że dodany związek “wypchnie” z dotychczasowych wiązań konkawalinę i zajmie jej miejsce – glukoza będzie miała bowiem zawsze większe powinowactwo do samej siebie niż do innego związku jakim jest omawiane białko roślinne. Technika swoje zastosowanie znalazła w: – izolacji czynników transkrypcyjnych (wszystkie są przecież białkami), – izolacji innych białek regulujących ekspresję genów przez to, że wiążą się z nicią DNA w ściśle określonych miejscach (sekwencjach). Efektywność jest tym większa im bardziej specyficzne jest oddziaływania danego białka z cząsteczkami mającymi je wychwycić. W celu poznania białek wiążących się z DNA należy zmodyfikować nieco powyższą procedurę, gdyż nośnik (żel) musi być związany ze specyficznymi fragmentami DNA (takimi do których powinny dołączyć się szukane białka). Chodzi przecież o to, aby po dodaniu roztworu z szukanymi białkami te same przyłączyły się do nici nukleinowej doczepionej do żelu. Teraz wystarczy jedynie przemyć (eluować) kolumnę z nośnikiem o dużym stężeniu soli i jak wiadomo białko po takim traktowaniu ulegnie strąceniu i uzyskamy jego czystą formę. Chromatografię powinowactwa stosuje się również w szerszym zakresie. Dla przykładu można podać sytuację, gdy chcemy wyizolować białka otrzymane na drodze wcześniejszej ekspresji klonowanych genów. Sam gen, który zawiera informację niezbędną do uzyskania białka musi jednak ulec pewnej modyfikacji. Dołącza się do niego bowiem sekwencję, która koduje dodatkowe aminokwasy (ale w miejscu, które już nie zmieni produktu białkowego). Jest to swoista “etykietka“, gdyż gdy ulegnie ona ekspresji (przetłumaczeniu kodu zasad z DNA na kod aminokwasowy)  poprzez kodowane aminokwasy stanie się znacznikiem powinowactwa. A bardziej obrazowo mówiąc, można do któregoś z końców (karboksylowego lub aminowego) białka poprzez tę zmianę dodać reszty histydynowe. Będzie to wtedy etykietka His. Takie białko przepuszcza się przez kolumnę w której znajdują się ziarna żelu  z kowalencyjnie przyłączonym niklem (dwuwartościowym) lub innymi jonami metalu. Wynikiem takiego działania będzie silne związanie się etykietki His (aminokwasu o dodatnim ładunku) wraz z białkiem do unieruchomionego jonu metalu. Pozostałe białka bez etykietki przepłyną przez kolumnę, a to które zostało w niej wymywa się przez dodanie imidazolu lub innego związku chemicznego, który zwiąże się z jonami metalu w żelu i wyprze przyłączone do niego białko. Chromatografia powinowactwa przeciwciał

Na rysunku przedstawiono wykorzystanie właściwości wiązania się danego biała z przeciwciałem w celu jego izolacji. W tym przypadku do ziarenek żelu w kolumnie przyczepione jest przeciwciało, które specyficznie wiąże się tylko z wybranym białkiem. To pozostanie zatem w kolumnie, a aby potem je od niej odczepić należy przemyć kolumnę kwaśnym buforem, który zerwie utworzone uprzednio wiązania (źródło: topbiomedical.com).

Podsumowując zasada na jakiej opiera się ta metoda pozwala nam wykorzystać spotykane normalnie własności wiązania się białek z rożnymi cząsteczkami, np. na zasadzie złączenia receptora z ligandem, enzymu z substratem czy antygenu z przeciwciałem (pokazanej powyżej).

Print Friendly, PDF & Email

Kategorie: Artykuły chemiczne,Chemia

Pozostaw odpowiedź

Materace w Rzeszowie
Cenimy swoich klientów, dlatego produkty które oferujemy charakteryzują się wysoką jakość wykonania. Materace rehabilitacyjne, luksusowe. Ponadto poduszki, narzuty.
materace-sklep-24.pl