ROZDZIELANIE ZWIĄZKÓW METODĄ CHROMATOGRAFII KOLUMNOWEJ. cz. 2
W pierwszej części artykułu o chromatografii kolumnowej napisałam, jak przygotować mieszaninę poreakcyjną do rozdziału z zastosowaniem kolumny chromatograficznej, jak wybrać „najlepszy” eluent, jak wybrać kolumnę, jak przygotować żel krzemionkowy i jak go nalać do kolumny. W drugiej części dodam kolejne informacje o przygotowywaniu kolumny oraz zaprezentuję, jak dalej dokonywać procesu rozdzielania związków.
Pierwszą część artykułu o chromatografii zakończyłam pytaniem, po co zaznaczam na kolumnie kreskę, po nalaniu do niej namoczonego żelu. Chcę zobaczyć, o ile mi się obniżył poziom żelu po jego ułożeniu, czyli obstukaniu kijem 🙂 Mnie po prostu wszystko ciekawi i wszystko muszę sprawdzić ;).
Ze zdjęcia poniżej wynika, że chcę stłuc biedną kolumnę kijem 😉 A tymczasem chcę w niej ułożyć żel. Obstukuję drewienkiem kolumnę we wszystkich miejscach, ostrożnie, by jej nie stłuc. Zamiast ubijać żel kijem, mogę mu pozwolić samoistnie osiadać, dolewając tylko eluentu, tylko ile to będzie trwało?
Jak zachowuje sie żel podczas obstukiwania?
Zdjęcie poniżej pokazuje już kolejny etap przygotowywania kolumny, ale o tym jeszcze napiszę :).
Odpowiedź na pytanie pod poprzednim zdjęciem: poziom żelu obniża się, żel „układa się” w kolumnie. Podczas obstukiwania kolumny drewienkiem możemy zauważyć, że z żelu wydostają sie pęcherzyki powietrza. Dobrze, że wydostają sie teraz, a nie podczas rozwijania kolumny, czyli podczas rozdziału kolumnowego, bo wtedy ten proces byłby zakłócony. Zatem, by ustrzec się tego, używam kija ;):
Kiedy tak obstukuję kolumnę kijaszkiem, poziom żelu obniża się, co zaznaczam pisakiem od czasu do czasu. Początkowo to obniżanie poziomu jest duże, potem coraz mniejsze, aż wreszcie poziom żelu przestanie sie obniżać. Kolumna jest prawie gotowa.
…Prawie ???
Jeśli podczas obstukiwania kolumny kijem poziom rozpuszczalnika, czyli eluentu, za bardzo spadnie, należy dodać go. Kiedy już żel jest w kolumnie ułożony, czyli jego poziom w kolumnie, mimo dalszego obstukiwania kijkiem, nie opada, czekamy, aż poziom eluentu nad żelem będzie wynosił z 5 mm. Wtedy wkładamy do kolumny krążek bibuły o wymiarach prawie takich, jak wewnętrzna średnica kolumny. Jeśli krążek jest właściwych wymiarów, równiutko spada w kolumnie na rozpuszczalnik, moczy sie w nim i spada na żel. Możemy bardzo ostrożnie, leciuteńko, przycisnąć ten krążek do żelu grubą bagietką, ale nie wolno nam naruszyć żelu !!!
Kiedy już krążek bibułki leży na powierzchni żelu, czekamy chwilkę, by spłynęło jeszcze trochę rozpuszczalnika, na tyle, by jego poziom nad poziomem żelu wynosił z 2 mm. Bierzemy pipetkę, nabieramy do niej roztworu tego, co ma być oczyszczane (rozdzielane) i…
…i ostrożnie spuszczamy powoli roztwór z pipetki na krążek bibuły leżący na żelu w kolumnie. Kolumna jest cały czas leciutko otwarta, by wyciek leniwie sobie kapał, podstawiamy pod kolumnę probówki i od tego momentu zbieramy wyciek do probówek. Dobrze by było, by na probówkach zaznaczyć ich objętość, by wszystkie zbierane frakcje miały np. 10 ml. Nanosimy na bibułkę cały roztwór, który nam łagodnie wsiąka w bibułkę i dalej w żel, gdzie jest odwracalnie adsorbowany.
Kolbkę płuczemy małą ilością rozpuszczalnika i ten roztwór również wlewamy do kolumny (tą samą pipetką). Jeżeli coś się nie rozpuściło i w roztworze, który nanosimy na krążek bibułki, coś pływa, to zostanie odsączone, by do żelu przechodził czysty, klarowny roztwór. Po to jest bibułka – spełnia rolę sączka :).
Czy ta bibułka jest koniecznie potrzebna? Ktoś mi kiedyś mówił, że ona jest wręcz zbędna, bo drobne śmieci zawarte w roztworze nie mają wpływu na rozdział kolumnowy. Oj, mają, mają, wiem to z własnego doświadczenia, toteż lepiej taki sączek z bibułki na powierzchni żelu umieścić. Zamiast bibułki można umieścić warstewkę piasku, ale wpierw należy go kilkakrotnie przemyć, m.in. wodą i etanolem oraz wysuszyć. Łatwiej wyciąć krążek bibułki ;).
Ktoś mi również zarzucił, że niepotrzebnie bawię się w pipetowanie roztworu. Można go nalewać wprost na bibułkę. Owszem, można, niejednokrotnie tak właśnie robię, ale należy robić to tak ostrożnie, by nie podniosła się bibułka i nie został naruszony żel.
Teraz możemy troszeczkę przyspieszyć kapanie, leciutko odkręcając kran kolumny. Roztwór „wsiąka” do żelu, gdzie jest na nim adsorbowany.
Kiedy już cały roztwór „wsiąknie” w żel, tą samą pipetką spłukujemy wewnętrzne ścianki kolumny odrobinką rozpuszczalnika, w którym była rozpuszczana substancja i czekamy, aż całość „wsiąknie”.
Zauważmy, że już następuje rozdzielanie się składników mieszaniny poreakcyjnej: najciemniejsze zanieczyszczenia prawie zostają na powierzchni żelu – mówimy, że zostają „na starcie” kolumny. Dalej można wyróżnić warstwę czerwoną, pomarańczową… Oczywiście nie zawsze kolory zostają na starcie, ale w przypadku moich związków tak właśnie jest :). Nie zawsze również jeden kolor oznacza jeden związek.
Kiedy juz spłuczemy wewnętrzne ścianki kolumny odrobinką eluentu i „wsiąknie” on w żel, zaczyna sie prawdziwe rozwijanie kolumny, czyli meritum procesu rozdziału kolumnowego. Na czym ten proces polega, można sobie poczytać w mądrych książkach, ja tylko przedstawiam, jak z technicznego punktu widzenia wygląda podział kolumnowy :).
Przypominam, że jeżeli rozpuszczaliśmy mieszaninę poreakcyjną np. w benzenie, a jako eluent będzie służył np. benzen z octanem etylu, to również żel był namoczony w samym benzenie, kolbka była spłukana benzenem i wewnętrzne scianki kolumny były spłukane benzenem. Dopiero kiedy te wszystkie benzeny „wsiąkną”, kładziemy na bibułkę kłębek waty i ostrożnie nalewamy eluentu, czyli rozpuszczalnika, bądź mieszaniny rozpuszczalników używanego do rozwijania kolumny. Ta watka jest po to, by podczas wlewania eluentu nie podskoczył nam krążek bibuły, a już nie daj Boże, żel. Moja koleżanka zamiast watki kładzie… kamyczek.
Na poniższym zdjęciu widzimy wyraźnie warstwy o różnym zabarwieniu. To są na ogół zanieczyszczenia.
Raz jeszcze przyjrzyjmy się okolicom krążka bibuły na żelu. Można zauważyć, że na powierzchni bibułki zebrało się trochę nierozpuszczalnego osadu, który mógłby zakłócać proces rozdziału.
Do probówek nam powoli kapie roztwór (ciekawe, co zawiera? 😉 ), za chwilę poziom eluentu dojdzie do watki… Jak uniknąć konieczności dolewania eluentu co chwilę? Jak sprawdzić, co nam nakapało? Co dalej zrobić z roztworami w probówkach? O tym napiszę w trzeciej, ostatniej, części artykułu. Zapraszam.
