Przepis na udaną elektroforezę w żelu agarozowym (DNA, RNA itp.)

  1. Ustalamy stężenie żelu agarozowego (w zależności od wymogów można użyć poliakrymidu) w jakim ma być przeprowadzona elektroforeza, najczęściej 1%.
  2. Odważamy np. 0,7 g agarozy, wsypujemy do pojemnika i dopełniamy do 70 ml buforu 1x TBE (raz stężonego).
  3. Wkładamy pojemnik do mikrofalówki na 1minutę po to by rozpuścić agarozę. Po minionym czasie wyjmujemy zlewkę z rozpuszczonym żelem, by lekko zamieszać i wkładamy na kolejne 30-60 sekund do podgrzania.
  4. Następnie stawiamy pojemnik na stole na ok. 5 – 10 minut aby się ostudziła do ok. 60˚C.
  5. Dodajemy 5 μl bromku etydyny w odpowiednim stężeniu, np. 10 mg/ml, który wchodzi między zasady kwasu nukleinowego (interkaluje) i pozwala na późniejszym etapie po światłem UV zlokalizować fragmenty DNA lub RNA. Mieszamy dodany odczynnik zasłaniająć najlepiej wylot zlewki. Bromek etydyny ze względu na opisane właściwości ma toksyczne, rakotwórcze właściwości – powoduje szkodliwe w skutkach  mutacje. Dlatego czynność dodawania bromku robi się przy założonych rękawicach i minimalizując parowanie roztworu.
  6. Wlewamy żel do sanek (wcześniej wkładamy przekładki, które decydują o rozmiarze żelu. Szerszą końcówką zużytego tipsa usuwamy powstałe bąbelki, które mogą zakłócić wynikowy obraz.
  7. Wkładamy grzebień, który uformuje w żelu dołki (studzienki) w które nałożone zostaną próbki.
  8. Czekamy aż żel stężeje – około 20 – 30 minut. Następnie wkładamy żel z sankami do naczynia od elektroforezy.
  9. Jeśli trzeba dolewamy raz stężonego buforu TBE, tak by żel był pokryty 2-5 mm warstwą cieczy (to tzw. running Buffet – bufor w którym dojdzie do rozwinięcia próbek na żelu).
  10. Dodajemy do pierwszego dołka marker, około 2 μl . Służy nam do określenia długości rozwijanego produktu.
  11. Załadowujemy próbki z właściwym, badanym materiałem – DNA, RNA, np. po PCR. Zwykle wstrzykuje się około 10 μl.
  12. Zamykamy aparat do elektroforezy. Podłączamy  ją do prądu I ustawiamy np. na 5V/cm. Elektroforeza trwa w zależności od ustawionego napięcia, ilości nakładanej próbki i stężenia żelu, zwykle około 30 – 45 min.
  13. Co jakiś czas sprawdzamy, czy próbki migrują w żelu oraz na stan rozwinięcia markera.
  14. Po minionym czasie wyłączamy aparat z prądu.
  15. Przenosimy żel do ciemni, gdzie obserwujemy w świetle UV (uwaga na oczy!) próbki z żelem zawierającym bromek etydyny.

Źródło: top-bio.cz

Wato pamiętać!

  • Aagaroza służy do rozdzielenia DNA, dla białek stosuje się żel poliakrylamidowy. W przypadku omawianej elektroforezy używa się aparatu ustawionego poziomo.
  • Dlaczego DNA migruje? Jak wiadomo jest to kwas, a zatem jest ujemnie naładowany w środowisku alkalicznym lub obojętnym. W polu elektrycznym wędrować będzie zatem do anody. Im dłuższa jest cząsteczka DNA lub RNA tym wolniej migruje (ma większą masę) przez pory żelu.
  • Oprócz barwnika EtBr istnieje wiele innych, które są bezpieczniejsze, ale i droższe. Popularną alternatywą dla bromku jest SYBR Green o 25- krotnie wyższej czułości barwienia dwuniciowego DNA.
  • Same próbki czasem w zwykłym świetle są bezbarwne dlatego dodaje się do nich przed nałożeniem odpowiedni barwnik (na zdjęciu wyżej). Pozwala to na obserwację migracji w żelu.
  • Czym jest agaroza? Agarem, substancją żelującą powstałą na drodze jej oczyszczenia z krasnorostów. Pod względem chemicznym to polisacharyd zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt
    heksozy. W postaci handlowej jest białym lub lekko żółtym proszkiem.

Your ads will be inserted here by

Easy Plugin for AdSense.

Please go to the plugin admin page to
Paste your ad code OR
Suppress this ad slot.

Print Friendly, PDF & Email

Kategorie: Chemia,Inne artykuły

Tagi: ,,,

1 Komentarz

Pozostaw odpowiedź