Jak oczyścić białko? cz.3

Opisane w poprzedniej części metody oczyszczania białek są najtańszymi, ale jednocześnie najmniej dokładnymi. Przejdziemy teraz do chromatografii, która pozwala nam na dużo lepsze pozbycie się zanieczyszczeń.

Chromatografia metodą filtracji żelowej

Filtracja żelowa pozwala na lepsze rozdzielenie cząsteczek o różnej wielkości. Gdy mamy roztwór białek, który chcemy oczyścić, nakładamy go na kolumnę chromatograficzną (o kształcie niewielkiej rurki, np. plastikowej), która wypełniona jest porowatymi ziarenkami. Zbudowane są one z nierozpuszczalnego, ale bardzo uwodnionego polimeru typu dekstran (złożony jest zatem z glukozy i ma wysoką ciężar cząsteczkowy) lub agaroza (ten wypełniacz również jest węglowodanem). Czasem zamiast nich stosuje się poliakryloamid.

W handlu istnieje wiele żeli do tego typu chromatografii, jak Sephadex, Biogel lub Sepharose. Ich ziarna mają średnicę 0,1 mm. Małe cząsteczki wnikają do ich wnętrza, podczas gdy większe z racji swych rozmiarów nie mogą tego zrobić. Co nam to daje? Rozdział cząsteczek. Małe molekuły pozostają rozpuszczone w wodnym roztworze, który znajduje się wewnątrz ziaren żelu lub pozostają związane między nimi. Natomiast większe przestrzenie pomiędzy ziarnami zajmują duże cząsteczki. Są one w roztworze wodnym, który może ściekać łatwiej w dół (nie są związane z ziarnami żelu).

Innymi słowy, objętość kolumny ma mniejszą dostępność dla dużych cząsteczek niż dla małych. Powoduje to, że duże cząsteczki przepływają przez nią szybciej i jako pierwsze pojawiają się u wylotu kolumny. Cząsteczki, które jedynie czasami mogą wniknąć do ziaren żelu wylatują z kolumny w pozycji pośredniej. Wynika to, jak wspomniałem wcześniej, z ich wielkości. Małe cząsteczki muszą pokonać najdłuższą drogę, która przez ziarna nie idzie po prostej linii, co sprawia, że one opuszczają kolumnę ostatnie. To właśnie z jednej z tych ściekających według rozmiaru frakcji jest nasze szukane białko.

Na zdjęciu niebieski roztwór zawiera duże cząsteczki, które nie wnikają do ziaren żelu i szybciej wypływają z kolumny. Następnie, po zmianie zlewki pod wylotem, spłyną mniejsze cząsteczki – najmniejsze pomarańczowe, które wnikają do ziaren, najdłużej pozostaną w kolumnie (Źródło: kelvin.com).

U wylotu mamy probówki, które co jakiś czas zmieniamy tak by w wybranej mieć określone białko. Może być to widoczne po innym kolorze rozdzielonej frakcji. Jak długo trwa taka chromatografia? Zależy to od żelu, rozmiarów jego ziaren i rozdzielanych białek. Może trwać pół godziny, ale na wyniki czasem trzeba czekać nawet parę godzin.

Your ads will be inserted here by

Easy Plugin for AdSense.

Please go to the plugin admin page to
Paste your ad code OR
Suppress this ad slot.

Print Friendly, PDF & Email

Kategorie: Artykuły biologiczne,Chemia

Tagi: ,,,,

Pozostaw odpowiedź

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.

Serwis biomist.pl
Testowy podgląd tekstu reklamy biomist.pl.
biomist.pl
Serwis biomist.pl
Testowy podgląd tekstu reklamy biomist.pl.
biomist.pl
Serwis biomist.pl
Testowy podgląd tekstu reklamy biomist.pl.
biomist.pl