Elektronowa mikroskopia skaningowa (SEM)

Agnieszka Kowalkowska, Natalia Wiśniewska

Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii, Katedra Cytologii i Embriologii Roślin

e-mail: agnieszka.kowalkowska@biol.ug.edu.pl

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) daje nam możliwość obserwacji ukształtowania powierzchni komórek roślinnych. Idea działania SEM polega na skanowaniu powierzchni próbki wiązką elektronów.

Przygotowanie materiału do SEM

Aby jak najlepiej zachować strukturę powierzchni badanego materiału niezbędne jest odpowiednie przygotowanie preparatu roślinnego. Materiał roślinny, który chcemy oglądać w mikroskopie skaningowym, np. części kwiatu, fragment liścia najlepiej pobrać bezpośrednio z rośliny do przygotowanych wcześniej odczynników: roztworu aldehydu glutarowego i paraformaldehydu w buforze fosforanowym lub kakodylowym.

Fig. 1. Elektronowy mikroskop skaningowy (SEM) w Laboratorium Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu Gdańskiego. Fot. A. Kowalkowska.

Fig. 2. Odczynniki do utrwalania materiału biologicznego. Fot. A. Kowalkowska.

Materiał utrwalamy od 4 do 24h, a następnie należy go odwodnić, czyli przepłukać różnymi stężeniami etanolu (począwszy od 10%, a skończywszy na 100%). W tej procedurze istotny jest czas pozostawania materiału w poszczególnych stężeniach etanolu. Następnym etapem jest pozbycie się płynu, czyli wysuszenie preparatów w punkcie krytycznym za pomocą ciekłego dwutlenku węgla (metoda CPD, 31°C, 73 at.). Metoda ta polega na wykorzystaniu zjawiska, że dwutlenek węgla w punkcie krytycznym przechodzi ze stanu płynnego w gazowy bez zniekształcania preparatów (Karcz J., SEM w biologii).

Fig. 3. Naczynko do suszenia w punkcie krytycznym (średnica otworu 0,5 cm). Fot. A. Kowalkowska.

Suszenie jest koniecznym etapem, gdyż w komorze mikroskopu skaningowego będziemy oglądać materiał w próżni i nie możemy wstawić tu preparatów uwodnionych Zatem pozbywamy się etanolu, zastępujemy go ciekłym dwutlenkiem węgla, a następnie w punkcie krytycznym ciekły CO₂ zamienia się w gazowy, a nasz preparat jest pozbawiony płynów bez artefaktów powstałych podczas suszenia. Aby uzyskać obraz w SEM, czyli by elektrony mogły odbić się od powierzchni oglądanego materiału, wysuszony materiał biologiczny umieszczony na specjalnych stolikach pokrywa się cienką warstewką złota lub platyny (dla pomysłowych: niestety nie da rady odzyskać szlachetnego kruszca po oglądaniu). Tak przygotowana ozłocona tkanka jest gotowa do analizy w mikroskopie skaningowym.

Fig. 4. Suszarka w punkcie krytycznym. Fot. A. Kowalkowska.

Fig. 5. Stoliki (o średnicy 2cm i 0,5 cm) z napylonym złotem materiałem roślinnym – płatki storczyków. Fot. A. Kowalkowska.

Budowa i zasady działania mikroskopu skaningowego

Mikroskop skaningowy składa się z :

• działa elektronowego (tu wytwarzana jest wiązka elektronów ),
• kolumny z układem soczewek elektromagnetycznych (gdzie następuję przyspieszanie i ogniskowanie wiązki elektronów),
• komory próbki, gdzie ma miejsce interakcja elektronów wiązki z próbką,
• zestawu detektorów ( scyntylator i fotopowielacz) odbierających różne sygnały emitowane przez próbkę,
• układu przetwarzającego sygnałów na obraz.

Po osiągnięciu próżni w komorze mikroskopu skaningowego wiązka elektronów skanuje powierzchnię próbki, stąd nazwa skaningowy. Elektrony odbite od powierzchni próbki (elektrony wtórne, elektrony wstecznie rozproszone) są następnie rejestrowane za pomocą odpowiednich detektorów, a następnie przetwarzane na obraz próbki na monitorze komputera. Po przetworzeniu danych uzyskuje się obrazy o dużej rozdzielczości i znacznej głębi ostrości. (z Teper E. Podstawy mikroskopii skaningowej).

Zasady powstawania obrazu w SEM

Obraz oglądany w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) nie jest obrazem rzeczywistym. To co widzimy w SEM jest obrazem wirtualnym skonstruowanym na bazie sygnałów emitowanych przez próbkę. Dzieje się to poprzez zeskanowanie linia po linii prostokątnego obszaru na powierzchni próbki. Obszar skanowania odpowiada fragmentom próby oglądanych na obrazie. W mikroskopie skaningowym możliwa jest obserwacja różnych rodzajów próbek: powierzchni, przekrojów poprzecznych i podłużnych, wycinków tkanek lub narządów pochodzących z obiektów utrwalonych chemicznie, skrawanych ręcznie lub mikrotomowo. Mikrofotografie otrzymywane w mikroskopie skaningowym są czarno-białe. Kolory są nakładane w drodze graficznej obróbki. Oczywiście, w artykułach naukowych, kolorów nie dodajemy.

Fig. 6. Schemat budowy elektronowego mikroskopu skaningowego (SEM) (za Teper E., Podstawy mikroskopii skaningowej).

Zastosowanie Skaningowej Mikroskopii Elektronowej

 Ze względu na jakość obrazu i możliwość otrzymania dużych powiększeń (nawet 3 000 000 x) SEM znalazło szerokie zastosowanie m. in. w:

• archeologii,
• biologii (wykorzystanie znajomości morfologii organelli komórkowych i błon cytoplazmatycznych w zrozumieniu funkcjonowania biologicznego organizmu żywego; histologia),
• ceramice,
• ekologii,
• elektronice,
• geologii (pozwala wykryć i rozpoznać bakterie, wirusy, pierwotniaki, grzyby czy inne pasożyty znajdujące się albo w organizmach żywych albo w paszy, glebie lub ściółce),
• historii sztuki,
• kryminalistyce,
• materiałoznawstwie (badanie i analizowanie powierzchni i obszarów przypowierzchniowych materiałów; analiza składu chemicznego materiałów),
• medycynie,
• metalurgii,
• przemyśle chemicznym i farmaceutycznym (badanie wpływu leków i kosmetyków na tkanki),
• przemyśle spożywczym.

Fig. 7. Viola banksii – kiełkujący pyłek. Fot. N. Wiśniewska.

Fig. 8. Viola odorata – otwarty aparat szparkowy znajdujący się szczytowej części miodnika. Fot. N. Wiśniewska.

Fig. 9, 10. Viola banksii – ziarno pyłku, zdjęcie z mikroskopu skaningowego przed i po obróbce w programie graficznym. Zdjęcie . Fot. N. Wiśniewska, obróbka graficzna A. Kowalkowska.