Białko jest cząsteczką, która buduje wszystkie istoty żywe. Ich mnogość struktur i funkcji jest ogromna. Jak jednak biochemicy i biolodzy molekularni wydobywają wybrane białka z tysięcy innych w komórce? Jakich technik używają by je oczyścić i poznać ich ilość w badanym materiale?
Wydobyć białko z komórki…
Najpierw trzeba się zdecydować co będzie źródłem białka. Jeśli ma być to hemoglobina to oczywiście będziemy ją izolować z czerwonych komórek krwi, jeśli białka kompleksu cytochromowego to będziemy szukać ich w liściach.
Gdy mamy już materiał do badań musimy wykonać test aby przekonać się czy na pewno izolowane białko tam się jeszcze znajduje. W przypadku wielu enzymów – białek ich aktywność spada, gdy przechowuje się je w nieodpowiednich warunkach. Przykładem jest tu polimeraza DNA.
W każdej komórce występuje ogromna ilość białek, a więc wydobycie z tej masy tego określonego nie jest zadaniem łatwym. Opracowano jednak testy, które oznaczają właściwości identyfikacyjne danego białka (jeśli zajdzie pozytywna reakcja oznacza to, że białko można izolować, bo tam jest). Warto dodać, że testy te wykonuje się na poszczególnych etapach oczyszczania, bo może się zdarzyć, że w pewnym momencie je utracimy, np. zdenaturuje (utraci swoją prawidłową strukturę, co jest związane ze stratą prawidłowej funkcji białka).
Łatwo wykonać taki test w przypadku enzymu – białka badając jego aktywność enzymatyczną. Trzeba jedynie dostarczyć odpowiednich substratów, a produkt który powstanie oznaczać będzie, że białko działa. Dla przykładu, gdy chcemy się przekonać czy w danym materiale występuje dehydrogenaza mleczanowa, która jest jednym z elementów procesu syntezy glukozy, należy dostarczyć jej mleczanu i NAD+ (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy. Produktami reakcji będą NADH, H+ i pirogronian.
Aktywność dehydrogenazy mierzy się w laboratorium poprzez badanie absorpcji NAD+, który przechodzi w formę zredukowaną NADH pod wpływem dehydrogenazy. Forma NADH wykazuje absorpcję przy 340 nm, podczas gdy NAD+ nie. Dzięki temu widzimy ilościowo proces przenoszenia protonów wodoru na NAD+ w wybranej jednostce czas, np. w ciągu 1 minuty.
Przy zastosowaniu określonej metody oczyszczania białek ważna jest też wiedza o ilości białka, która mieści się w danej mieszaninie. Mając tę daną można bowiem wyliczyć aktywność specyficzną, czyli stosunek aktywności enzymatycznej w stosunku do ilości białka w badanej próbie, np. 3U/mg (U – jednostka enzymatyczna, mg – miligram białka). Im późniejszy etap oczyszczania białka tym aktywność specyficzna powinna wykazywać wyższe wartości (jest mniej zbędnych zanieczyszczeń, które by blokowały jego aktywność). Celem oczyszczania białek jest w istocie osiągniecie maksymalnej aktywności specyficznej.
Jak sprawdzić stężenie danego białka? W laboratorium korzysta się ze spektrofotometru, który mierzy absorpcję danej substancji (pochłanianie przez nią promieni światła o wybranej długości). Dla danego białka i określonych dokładnie wybranych jego stężeń odczytuje się wartość absorpcji. Na podstawie tych odczytów wykonuje się krzywą kalibracyjną (zależność stężenia białka od wartości absorpcji). Gdy mamy roztwór białka o nieznanym stężeniu wystarczy zmierzyć jego absorpcję i sprawdzić położenie tej wartość na krzywej oraz odpowiadające jej stężenie białka.
Przed przystąpieniem do izolacji białka ustalamy zatem materiał źródłowy, jak i test, który wykonywamy by go zidentyfikować. Białka trzeba jednak sfrakcjonować. Są przecież rozlokowane w komórkach, które są pełne innych niepotrzebnych białek. Frakcjonowanie polega na takiej przeróbce materiału aby uzyskać frakcje (warstwy), które zawierają interesujące nas białko. Cały proces przedstawmy w etapach:
1) Rozrywamy błony komórkowe, co powoduje powstanie homogenatu komórkowego.
2) Frakcjonujemy homogenat poprzez wirowanie, tak by otrzymać gęsty osad ciężkich fragmentów komórek na dnie próbówki, a lekkich kawałków nad nim (roztwór nad osadem nazywa się supernatantem).
Wirowanie różnicowe prowadzi do uzyskania kilku frakcji o coraz mniejszej gęstości warstw, a w każdej są setki białek. Polega ono na przykład na tym, że najpierw wiruje się homogenat przy prędkości 500 g w wyniku czego w osadzie znajduje się frakcja jądrowa. Następnie bierzemy supernatant i wkładamy do probówki, którą wirujemy z większą szybkością obrotów, np. 10000 g co daje nam w osadzie frakcję mitochondrialną. Gdy zwirujemy supernatant przy 100 000 w osadzie znajdą się cięższe mikrosomy, a w supernatancie cytozol. Oczywiście to przykładowe wyniki, a dla określonych sytuacji wirowanie ma inny przebieg.
3)Pobieramy wybraną warstwę (po wirowaniu) w której spodziewamy się białka i wykonujemy na nim test identyfikujący oczyszczaną proteinę. Jedna z frakcji powinna wykazywać zwiększoną aktywność w ramach testu i to ona służy nam dalej do przeprowadzenia wybranych metod oczyszczania. Ale o tym w następnej części…
