- Ustalamy stężenie żelu agarozowego (w zależności od wymogów można użyć poliakrymidu) w jakim ma być przeprowadzona elektroforeza, najczęściej 1%.
- Odważamy np. 0,7 g agarozy, wsypujemy do pojemnika i dopełniamy do 70 ml buforu 1x TBE (raz stężonego).
- Wkładamy pojemnik do mikrofalówki na 1minutę po to by rozpuścić agarozę. Po minionym czasie wyjmujemy zlewkę z rozpuszczonym żelem, by lekko zamieszać i wkładamy na kolejne 30-60 sekund do podgrzania.
- Następnie stawiamy pojemnik na stole na ok. 5 – 10 minut aby się ostudziła do ok. 60˚C.
- Dodajemy 5 μl bromku etydyny w odpowiednim stężeniu, np. 10 mg/ml, który wchodzi między zasady kwasu nukleinowego (interkaluje) i pozwala na późniejszym etapie po światłem UV zlokalizować fragmenty DNA lub RNA. Mieszamy dodany odczynnik zasłaniająć najlepiej wylot zlewki. Bromek etydyny ze względu na opisane właściwości ma toksyczne, rakotwórcze właściwości – powoduje szkodliwe w skutkach mutacje. Dlatego czynność dodawania bromku robi się przy założonych rękawicach i minimalizując parowanie roztworu.
- Wlewamy żel do sanek (wcześniej wkładamy przekładki, które decydują o rozmiarze żelu. Szerszą końcówką zużytego tipsa usuwamy powstałe bąbelki, które mogą zakłócić wynikowy obraz.
- Wkładamy grzebień, który uformuje w żelu dołki (studzienki) w które nałożone zostaną próbki.
- Czekamy aż żel stężeje – około 20 – 30 minut. Następnie wkładamy żel z sankami do naczynia od elektroforezy.
- Jeśli trzeba dolewamy raz stężonego buforu TBE, tak by żel był pokryty 2-5 mm warstwą cieczy (to tzw. running Buffet – bufor w którym dojdzie do rozwinięcia próbek na żelu).
- Dodajemy do pierwszego dołka marker, około 2 μl . Służy nam do określenia długości rozwijanego produktu.
- Załadowujemy próbki z właściwym, badanym materiałem – DNA, RNA, np. po PCR. Zwykle wstrzykuje się około 10 μl.
- Zamykamy aparat do elektroforezy. Podłączamy ją do prądu I ustawiamy np. na 5V/cm. Elektroforeza trwa w zależności od ustawionego napięcia, ilości nakładanej próbki i stężenia żelu, zwykle około 30 – 45 min.
- Co jakiś czas sprawdzamy, czy próbki migrują w żelu oraz na stan rozwinięcia markera.
- Po minionym czasie wyłączamy aparat z prądu.
- Przenosimy żel do ciemni, gdzie obserwujemy w świetle UV (uwaga na oczy!) próbki z żelem zawierającym bromek etydyny.
Źródło: top-bio.cz
Wato pamiętać!
- Aagaroza służy do rozdzielenia DNA, dla białek stosuje się żel poliakrylamidowy. W przypadku omawianej elektroforezy używa się aparatu ustawionego poziomo.
- Dlaczego DNA migruje? Jak wiadomo jest to kwas, a zatem jest ujemnie naładowany w środowisku alkalicznym lub obojętnym. W polu elektrycznym wędrować będzie zatem do anody. Im dłuższa jest cząsteczka DNA lub RNA tym wolniej migruje (ma większą masę) przez pory żelu.
- Oprócz barwnika EtBr istnieje wiele innych, które są bezpieczniejsze, ale i droższe. Popularną alternatywą dla bromku jest SYBR Green o 25- krotnie wyższej czułości barwienia dwuniciowego DNA.
- Same próbki czasem w zwykłym świetle są bezbarwne dlatego dodaje się do nich przed nałożeniem odpowiedni barwnik (na zdjęciu wyżej). Pozwala to na obserwację migracji w żelu.
- Czym jest agaroza? Agarem, substancją żelującą powstałą na drodze jej oczyszczenia z krasnorostów. Pod względem chemicznym to polisacharyd zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt
heksozy. W postaci handlowej jest białym lub lekko żółtym proszkiem.
a co z elektroforezą RNA w warunkach denaturujących ("aldehydowa")