Diagnostyka molekularna alergii

Zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Alergii, diagnostyka alergii opiera się na 3 etapach. Pierwszym z nich jest zebranie szczegółowego wywiadu dot. występujących u danego pacjenta objawów oraz czasu ich prezentacji. Pozwala to określić dalszy wybór ścieżki diagnostycznej. Drugi etapem jest wykonanie testów skórnych lub z krwi. Tradycyjne metody diagnostyczne takie jak punktowe testy skórne mają swoje ograniczenia –  wymagają specjalnego przygotowania pacjenta do badań. Pacjent musi odstawić leki przeciwalergiczne czy sterydowe, przed pobraniem krwi musi być na czczo. Nie jest również dedykowana chorym w każdym wieku (obniżona reaktywność skóry u dzieci poniżej 5 r.ż. i u osób starszych). Trzecim krokiem jest diagnostyka molekularna, jednak uważa się, że doświadczony alergolog może już w drugim etapie przeprowadzać testy molekularne.

Diagnostyka serologiczna to jedna z podstawowych metod wykrywania specyficznych IgE przeciwko alergenom wziewnym, pokarmowym czy jadów owadów. Testy z krwi można wykonywać na pojedyncze alergeny lub wykonuje się je w konkretnych panelach (zestawach) zawierających od 6 do 30 alergenów. Podstawą diagnostyki molekularnej jest wykrywanie konkretnych składowych alergenów (obok źródła alergii), odpowiedzialnych za powstanie reakcji alergicznej, czy będących przyczyną reakcji krzyżowej na inne alergeny. W przypadku testów III generacji, tzw. testach multiparametrowych równocześnie można badać molekuły i ekstrakty alergenowe. Wynik negatywny takiego testu zasadniczo jest podstawą wykluczenia w mechanizmie IgE-zależnym.

Wskazania do diagnostyki serologicznej

• stosowanie leków przeciwhistaminowych – nie wpływają na wyniki
• ryzyko reakcji uogólnionych po kontakcie z alergenem, nieodpowiednie dla kobiet w ciąży i pacjentów, u których w przeszłości wystąpiły reakcje anafilaktyczne np. na jad owadów
• trudne do zidentyfikowania czynniki uczulające
• problem z wyborem właściwej terapii – odczulania bądź unikania danego alergenu; brak rezultatów w wprowadzonej diety eliminacyjnej
• obecność chorób skórnych fizycznie uniemożliwia wykonanie testów skórnych u pacjenta oraz ich odczyt (AZS)
• występowanie alergii poliwalentnej na alergeny wziewne i pokarmowe

Jak zbudowany jest alergen?

Alergeny to niewielkie, głównie białkowe związki, które wywołują ogólną lub miejscową reakcję alergiczną, zależną od przeciwciał IgE lub niezależną od nich. W testach serologicznych wykorzystuje się:

• ekstrakt alergenowy, czyli niefrakcjonowaną mieszaninę różnych alergizujących i niealergizujących białek, polisacharydów, lipidów uzyskanych przez ekstrakcję ze źródła alergenu (np. ziarna pyłku, owoce, sierść zwierząt)
  • są uzyskiwane z naturalnych źródeł alergenowych
  • wymagają precyzyjnej standaryzacji
  • dokładny skład i zawartość alergenów w wyciągach są niemożliwe do przewidzenia i zależą od wielu czynników (np. degradacji białek, heterogenności źródeł alergenów)
  • zawartość alergenów (nawet głównych) może znacząco się różnić miedzy szczególnymi seriami
  • możliwe są zanieczyszczenia ekstraktów alergenami pochodzącymi z innych źródeł

• molekułę (składnik/ komponent) – to cząsteczka (białko lub glikoproteina), posiadająca unikalną budowę cząsteczki i właściwości, pochodząca z określonego źródła alergenowego;
  • ma zdolność wiązania swoistego przeciwciała
  • natywne (naturalne), izolowane z naturalnych źródeł alergenów
  • rekombinowane – wytwarzane z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA

Grupy białek istotne w alergologii

Każda z molekuł jest przyporządkowana do określonej grupy białek, charakteryzujących się konkretnymi właściwościami, takimi jak:

• ciężkość wywoływanych objawów – pozwala oszacować stopień ryzyka wystąpienia reakcji anafilaktycznej
• odporność na działanie temperatury i enzymów trawiennych
• występowanie reaktywności krzyżowej

Największe ryzyko  anafilaksji występuje w przypadku molekuł zaliczanych do rodziny nsLTP (Pru p3 brzoskwini) oraz białek zapasowych roślin (Ara h 2 i Ara h 1 orzecha ziemnego). Po zjedzeniu brzoskwini  objawy alergii mogą nie wystąpić, jednak u osoby uczulonej na molekułę Pru p3, pod wpływem kofaktora, czyli czynnika wyzwalającego anafilaksję, mogą pojawić się ciężkie objawy, a nawet wstrząs. Do kofaktorów zaliczamy: wysiłek fizyczny, alkohol, miesiączka, niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ).

Przykładowo, alergen mleka składa się z około 30 różnych białek. Każde z nich może uczulać pacjenta i być odpowiedzialne za reakcje uczuleniowe. Bardzo rzadko uczula cały alergen, tylko jedna lub kilka z molekuł budujących dany alergen. Pacjent uczulony na molekułę Bos d 8 mleka krowiego, czyli kazeinę, nie będzie mógł spożywać mleka pod żadną postacią, ani surowego, ani gotowanego. Kazeina jest białkiem termostabilnym, co oznacza, że jest odporne na działanie temperatury i enzymów trawiennych. Poddanie mleka obróbce termicznej (np. przez gotowanie) nie zmniejsza alergenowości kazeiny. Jakikolwiek kontakt z mlekiem u pacjenta uczulonego na kazeinę może wywołać ciężkie reakcje anafilaktyczne.

Zupełnie inaczej będzie wyglądało uczulenie, jeśli dotyczy białka Bos d 5, czyli β-laktoglobuliny. Pacjent z takim uczuleniem otrzyma całkiem inne zalecenia dietetyczne niż osoba uczulona na kazeinę.  Molekuła Bos d 5 jest białkiem termolabilnym, pod wpływem gotowania traci swoją moc uczuleniową. Odpowiednia obróbka termiczna spowoduje, że pacjent będzie mógł spożywać produkty mleczne, a ryzyko ciężkich reakcji anafilaktycznych u niego będzie niskie.

Kolejną z grup białek stanowią reagujące krzyżowo determinanty węglowodanowe (CCD) – nie mają one znaczenia klinicznego (nie są zdolne do inicjacji reakcji alergicznej), ale mogą wpływać na wynik w testach serologicznych. Struktury CCD obecne są w takich alergenach jak: pyłek traw i drzew, pokarmach pochodzenia roślinnego, lateksie oraz jadach owadów błonkoskrzydłych. Szacuje się, że około 25% pacjentów z alergią wytwarza przeciwciała IgE anty-CCD i są przyczyną wyników fałszywie dodatnich w testach in vitro, nie reagują w testach in vivo. W testach alergicznych coraz częściej stosuje się marker (pasmo) CCD – informuje o ewentualnym wpływie przeciwciał anty-CCD na wynik.

Zalety diagnostyki molekularnej

• identyfikacja komponenty alergenowej odpowiedzialnej za reakcję alergiczną i ryzyko reakcji ogólnoustrojowej
• skrócenie czasu postawienia diagnozy
• określenie „profilu molekularnego” alergii pacjenta; ułożenie spersonalizowanego planu dietetycznego  w przypadku alergii pokarmowych
• monitorowanie zmian uczulenia na dany alergen w dalszej perspektywie czasu; określenie prawdopodobieństwa nabycia tolerancji
• identyfikacja komponentów głównych przed planowanym odczulaniem (trawy, drzewa, jady owadów)
• zwiększona czułość badania – wykrywanie molekuły, której stężenie w pełnym ekstrakcie jest niskie oraz dzięki zastosowaniu  rekombinowanych komponentów charakteryzujących się większą stabilnością i brakiem efektu maskowania niektórych epitopów alergenowych w pełnym ekstrakcie
• różnicowanie rzeczywistej alergii poliwalentnej od wyników spowodowanych reakcjami krzyżowymi (identyfikacja nieistotnych klinicznie przeciwciał anty-CCD)
• większa standaryzacja i lepsza powtarzalność wyników

Ograniczenia metody

Diagnostyka molekularna  jest dziedziną ciągle doskonaloną. Jednym z ograniczeń metody jest liczba opisanych i dostępnych do badania molekuł. Pacjent może uzyskać pozytywny wynik dla danego ekstraktu alergenowego, a molekuły tego ekstraktu dostępne na teście będą ujemne. Oznacza to, że badana osoba ma alergię na komponentę danego alergenu, która nie jest jeszcze dostępna w testach molekularnych, gdyż nie została jeszcze opisana lub odkryta.

Bibliografia:

1. Alergia w molekularnym świecie, prof. B. Samoliński, Strefa Alergii 01/2021
2. Testy wieloparametrowe do diagnostyki molekularnej alergii – aktualne możliwości, Lis K., Bartuzi Z.:. Alergia Astma Immunologia 2020, 25 (3): 122-140
3. Serologiczna diagnostyka alergii – zalety i ograniczenia. Testy molekularne w praktyce, Euroimmun Blog

Autor: Agnieszka Góra, diagnosta laboratoryjny