Oznaczanie lekowrażliwości bakterii

1 125


Jednym z najistotniejszych problemów medycyny XXI wieku jest narastająca oporność na leki przeciwdrobnoustrojowe wśród wielu powszechnie występujących gatunków bakterii. Jest to zjawisko coraz bardziej niepokojące, gdyż lekooporne szczepy bakteryjne są izolowane zarówno z zakażeń szpitalnych, jak i pozaszpitalnych, co stanowi poważny problem diagnostyczny, terapeutyczny oraz epidemiologiczny. Przypuszcza się, że w 2050 roku lekooporność bakterii będzie główną przyczyną zgonów, a ich liczba może sięgać nawet 10 milionów rocznie. Nadużywanie leków przeciwbakteryjnych, jak również ich niewłaściwe stosowanie w medycynie, rolnictwie i przemyśle to podstawowe czynniki odpowiedzialne za rozwój i szerzenie się lekooporności na całym świecie. Wg aktualnych danych dot. konsumpcji antybiotyków w krajach Unii Europejskiej, w 2016r. przeciętny poziom zużycia antybiotyków w środowisku pozaszpitalnym (lecznictwo otwarte) w Polsce wynosił 24 DDD (ang. defined daily dose, dawka dobowa definiowana) na 1000 mieszkańców na dzień i był wyższy od średniej europejskiej. W środowisku szpitalnym (lecznictwo zamknięte) przeciętna konsumpcja antybiotyków kształtowała się na niższym niż średnia europejska poziomie wynoszącym 1,36 DDD na 1000 mieszkańców na dzień. Leki przeciwbakteryjne są także powszechnie stosowane w hodowlach zwierząt – kontrola NIK (Najwyższa Izba Kontroli) wykazała, że aż 70% hodowców w woj. lubuskim stosowało antybiotyki w nieuzasadnionych przypadkach leczniczych.

Terapia zakażeń wywoływanych przez szczepy lekooporne staje się coraz bardziej nieskuteczna. Obserwuje się znaczącą dysproporcję pomiędzy dynamiką narastania tego zjawiska a możliwościami pozyskiwania nowych, skutecznych opcji terapeutycznych wobec wielolekoopornych drobnoustrojów. Pod wpływem presji antybiotykowej dochodzi do selekcji szczepów bakterii opornych na wiele dotąd stosowanych antybiotyków i chemioterapeutyków.

Za szczepy wielolekooporne (ang. multidrug- resistance, MDR) uważa się drobnoustroje wykazujące oporność na co najmniej jeden lek z trzech lub więcej grup związków przeciwbakteryjnych mających zastosowanie wobec danego gatunku bakterii. Drobnoustroje mogą być także klasyfikowane jako szczepy
o rozszerzonej oporności
(ang. extensively drug resistant, XDR) wrażliwe maksymalnie
na dwie grupy antybiotyków stosowanych w danym wskazaniu, a także jako szczepy oporne na wszystkie leki ze wszystkich grup (ang. pandrug-resistance, PDR) stosowanych w terapii zakażeń.

Ryzyko nastania ery post-antybiotykowej jest realne i stanowi ogromne wyzwanie dla ludzkości. Mając na uwadze powyższe dane, zjawisko szerzącej się antybiotykooporności określane jest jako jeden z najwyższych priorytetów zdrowia publicznego. Powstało wiele strategii przeciwdziałających rozwijaniu się oporności bakteryjnej przygotowanych m.in. przez Światową Organizację Zdrowia (ang. World Health Organization, WHO), amerykańskie Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (ang. Centers for Disease Control and Prevention, CDC), Europejskie Centrum Profilaktyki i Kontroli Zakażeń (ang. European
Centre for Disease Prevention and Control, ECDC), a także przez polskie Ministerstwo Zdrowia poprzez utworzenie Narodowego Programu Ochrony Antybiotyków (NPOA). Projekty te polegają na promowaniu zasad racjonalnej antybiotykoterapii, skoordynowanym nadzorze nad zakażeniami wywołanymi przez szczepy wielooporne, a także na wspieraniu projektów badawczych w poszukiwaniu nowych związków przeciwbakteryjnych. Należy podkreślić, że współczesna medycyna musi zająć się problemem szczepów MDR w ten sam sposób jak profilaktyką HIV lub malarii.

Cel oznaczania lekowrażliwości

a) w celu wprowadzenia terapii celowanej, czyli opartej na wyniku oznaczenia lekowrażliwości – popartej dowodami, ze dany szczep jest faktycznie wrażliwy na ten lek

b) wśród bakterii występuje bardzo duża zmienność w zakresie wrażliwości/oporności na leki

c) bakterie mogą wykształcać mechanizmy oporności przeciwko powszechnie stosowanym antybiotykom/chemioterapeutykom(np. na skutek wymiany plazmidów z inną bakterią)

Oporność na leki związana z wytwarzaniem enzymów


Spośród wielu strategii oporności na związki przeciwbakteryjne można wyróżnić inaktywację enzymatyczną w wyniku wytwarzania enzymów katalizujących reakcje hydrolizy bądź modyfikacji stosowanych antybiotyków oraz chemioterapeutyków. Antybiotyki β-laktamowe to grupa leków często stosowanych w terapii zakażeń bakteryjnych, jednak z uwagi na zjawisko narastającej oporności mogą okazać się one nieskuteczne. Mechanizmem o największym znaczeniu dla oporności na β-laktamy
u bakterii Gram-ujemnych jest wytwarzanie enzymów – β-laktamaz odpowiedzialnych za hydrolizę wiązania amidowego w cząsteczce leku. Większość drobnoustrojów posiada własne, gatunkowo specyficzne β-laktamazy, natomiast wśród poszczególnych szczepów danego gatunku coraz częściej występuje oporność nabyta, która jest związana ze zmianami genetycznymi w bakteryjnym genomie. Zakres i stopień oporności danego szczepu na β-laktamy jest uwarunkowany rodzajem oraz poziomem ekspresji wytwarzanych przez bakterię β-laktamaz. Enzymy te mogą być wytwarzane przez komórkę bakteryjną na stałym poziomie (ekspresja konstytutywna) bądź w sposób regulowany, zależny od obecności induktora (ekspresja indukowana). W wyniku mutacji w genach regulatorowych proces syntezy β- laktamaz o charakterze indukowanym może przebiegać na wysokim poziomie przez cały czas, bez względu na obecność induktora. Zjawisko to określa się mianem derepresji i może ono prowadzić do selekcji szczepów bakteryjnych opornych na wszystkie grupy β-laktamów. β-laktamazy są klasyfikowane m.in. według dwóch systemów: funkcjonalnego oraz strukturalnego. System funkcjonalny, zaproponowany przez Bush i Jacoby’ego, uwzględnia spektrum substratowe β-laktamaz oraz ich podatność na hamowanie przez inhibitory β-laktamowe (kwas klawulanowy, sulbaktam oraz tazobaktam) oraz EDTA i NaCl. Natomiast podział strukturalny autorstwa Amblera jest utworzony w oparciu o analizę sekwencji nukleotydowych enzymów i grupuje je na cztery klasy oznaczone literami alfabetu: A, B, C, D. Klasa A obejmuje penicylinazy – β-laktamazy serynowe podatne na hamowanie przez inhibitory, hydrolizujące głównie penicyliny i cefalosporyny I generacji (np. klasyczne enzymy TEM-1, SHV-1), a także dodatkowo cefalosporyny III generacji lub karbapenemy. Klasa B to metalo-β-laktamazy (MBL) zawierające jony cynku w centrum aktywnym, a ich zakres substratowy obejmuje
wszystkie antybiotyki β-laktamowe oprócz aztreonamu. Są one hamowane m.in. przez czynniki kompleksujące kationy metali (np. EDTA). Wśród najistotniejszych klinicznie rodzin enzymów tej klasy można wyróżnić: IMP (ang. imipenemase metallo- β- lactamase), VIM (ang. Verona integron-encoded metallo- β- lactamase) oraz NDM (ang. New Delhi metallo-β-lactamase). Do klasy C należą cefalosporynazy – β- laktamazy serynowe preferujące cefalosporyny, ale aktywne także względem
penicylin i monobaktamów. Są niewrażliwe na działanie inhibitorów. Głównymi przedstawicielami tej klasy są enzymy AmpC. Klasa D obejmuje oksacyklinazy (OXA) – grupę enzymów o szerokim spektrum substratowym obejmującym penicyliny (w tym oksacylinę w odróżnieniu od penicylinaz), a niektóre warianty unieczynniają dodatkowo karbapenemy lub cefalosporyny. Nie ulegają one hamowaniu przez inhibitory β-laktamowe.

W odpowiedzi na wprowadzenie do lecznictwa kolejnych rodzajów i generacji
antybiotyków β-laktamowych, nastąpił intensywny proces ewolucji β-laktamaz.
Na całym świecie pojawiły się nowe enzymy określane jako β-laktamazy o rozszerzonym
spektrum substratowym ESβL (ang. extended spectrum β-lactamase) oraz
karbapenemazy, których zakres działania obejmuje zdecydowaną większość β- laktamów.
Wykrywane u bakterii enzymy ESβL są zdolne do hydrolizy penicylin,
monobaktamów oraz cefalosporyn (z wyjątkiem cefamycyn). Wiele z nich może być
podatna na inhibicję kwasem klawulanowym, tazobaktamem bądź sulbaktamem. Są one
wytwarzane de novo lub powstają w wyniku mutacji punktowych w genach kodujących
inne β-laktamazy. Wg klasyfikacji Amblera ESβL należą do klasy A (m.in. rodziny
CTX- M, SHV, TEM, VEB, PER) oraz klasy D (np. OXA-11, OXA-16).
Karbapenemy to β-laktamy stosowane w terapii ciężkich zakażeń wywołanych przez
lekooporne pałeczki Gram-ujemne, a wielu sytuacjach są traktowane jako leki ostatniej
szansy. Jednak w ciągu ostatnich lat obserwuje się wzrost odsetka szczepów opornych na
tę grupę leków, który wynika przede wszystkim ze zdolności wytwarzania enzymów –
karbapenemaz. Wśród pałeczek Gram-ujemnych najczęściej izolowane są
karbapenemazy takie jak:
– KPC (ang. Klebsiella pneumoniae carbapenemase) – należące do klasy A
wg Amblera; wykazują właściwości hydrolityczne wobec wszystkich grup
antybiotyków β-laktamowych,
– MBL – reprezentujące klasę B, nierozkładające tylko monobaktamów,
– CHDL (ang. carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase) – ich zakres
substratowy obejmuje nie tylko karbapenemy, lecz również penicyliny
i cefalosporyny I generacji; reprezentowane m.in. przez OXA-48, OXA-51,
OXA-23, OXA-58, OXA-40.

Modyfikacja enzymatyczna jest również głównym mechanizmem oporności na inne
grupy leków – aminoglikozydy oraz chloramfenikol. Pałeczki Gram-ujemne wytwarzają
enzymy modyfikujące aminoglikozydy – AME (ang. aminoglycoside-modifying
enzyme), do których zaliczane są nukleotydotransferazy ANT (ang. aminoglycoside
nucleotidyltransferase), fosfotransferazy APH (ang.aminoglycoside phosphotransferase)
oraz acetylotransferazy AAC (ang. aminoglycoside acetyltransferase). Z kolei oporność
na chloramfenikol wynika z ekspresji acetylotransferazy CAT (ang. chloramphenicol
acetyltransferases) inaktywującej cząsteczkę tego antybiotyku.

Oporność nieenzymatyczna


Oporność szczepów bakteryjnych na różne grupy leków warunkują także
mechanizmy nieenzymatyczne, do których zaliczane są: zmniejszona przepuszczalność
błony zewnętrznej, aktywny wyrzut leków przez pompy błonowe (ang. efflux pumps),
zmiany w miejscu docelowego działania leku oraz wytwarzanie biofilmu.
Za przepuszczalność osłon komórkowych bakterii Gram-ujemnych odpowiedzialne
są m.in. obecne w błonie białka porynowe tworzące kanały transportowe dla różnych
substancji, w tym antybiotyków i chemioterapeutyków, do wnętrza komórki.
Powstawanie oporności na różne grupy związków, może wynikać ze zmian w błonie
zewnętrznej i polega m.in. na zmniejszeniu poziomu ekspresji białek porynowych,
zmianach w ich budowie lub funkcji.
Aktywne usuwanie z komórki bakteryjnej różnego typu toksycznych substancji przez
pompy błonowe determinuje oporność na leki wśród wielu istotnych klinicznie gatunków
drobnoustrojów. Pompy te wykazują różne powinowactwo do substratów
– mogą transportować konkretny rodzaj substancji bądź wiele różnych grup związków.
Dotychczas poznane systemy pomp reprezentują pięć rodzin: MFS (ang. major facilitator
superfamily), SMR (ang. small multidrug resistance family), MATE (ang. multidrug and
toxic compound extrusion family), ABC (ang. ATP binding cassette superfamily) i RND
(ang. resistance-nodulation-cell division family). Najbardziej rozpowszechnione wśród
pałeczek Gram- ujemnych są pompy błonowe z rodziny RND (m.in. AcrAB-TolC
i MexAB-OprM).
Kolejnym mechanizmem warunkującym lekooporność są zmiany w miejscu
docelowym działania leku. Mogą one powstawać wg dwóch schematów. Pierwszy z nich
zachodzi na drodze mutacji w genach kodujących pożądany punkt uchwytu, powodując
ekspresję zmienionego białka pozbawionego zdolności łączenia się z cząsteczką leku.
Drugi schemat modyfikowania miejsca docelowego wiązania leku polega na ekspresji
białek protekcyjnych zapobiegających łączeniu się cząsteczki związku
przeciwbakteryjnego z punktem uchwytu. Obydwa typy zmian mogą mieć
udział w przypadku oporności na chinolony oraz fluorochinolony. W chromosomie
bakteryjnym powstają mutacje w genach gyr i/lub par, odpowiedzialnych za syntezę
gyrazy DNA oraz topoizomerazy IV – miejsca wiązania tych chemioterapeutyków,
wskutek czego leki stają się nieskuteczne. Region chromosomu, w którym powstają
te zmiany nazywany jest obszarem warunkującym oporność na chinolony
(ang. quinolone resistance-determining region, QRDR). Lekooporne szczepy

bakteryjne mogą również wytwarzać białka Qnr, blokujące powstawanie kompleksu
fluorochinolon-enzym-DNA.
Modyfikacja miejsca docelowego działania antybiotyku związana jest również
z opornością na polimyksyny. Związki te charakteryzują się powinowactwem
do składnika błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych – lipopolisacharydu (LPS).
Powierzchniowy ładunek LPS może ulec obniżeniu w wyniku zmian w strukturze
lipidu A, co skutkuje brakiem punktu uchwytu dla tych antybiotyków na powierzchni
komórki bakteryjnej.
Jednym z intensywnie badanych mechanizmów lekooporności jest zdolność
do tworzenia biofilmu. Jest to złożona struktura utworzona z komórek drobnoustrojów
jednego lub kilku gatunków bakterii otoczonych warstwą zewnątrzkomórkowej
macierzy. Stanowi ona istotny czynnik determinujący chorobotwórczość, szczególnie
w środowisku szpitalnym, ze względu na możliwość jego rozwoju zarówno
na powierzchniach biotycznych, jak i abiotycznych – materiałach oraz sprzęcie
medycznym takim jak rurki dotchawicze bądź różnego typu cewniki. Bakterie rosnące
w postaci biofilmu wykazują zmniejszoną wrażliwość na działanie środków
przeciwdrobnoustrojowych. Wykazano związek pomiędzy zdolnością wytwarzania
biofilmu przez szczepy bakteryjne a opornością na różne grupy antybiotyków, jednak
nie zaobserwowano zwiększonej produkcji macierzy u szczepów MDR.

Podstawowe terminy

Antybiogram – oznaczenie lekowrażliwości; może być podstawowy (obejmuje podstawowe, najczęściej używane antybiotyki) lub rozszerzony (oznaczanie lekowrażliwości na leki rzadziej używane, bardziej specyficzne)

MIC – najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii w warunkach In vitro, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. Wyrażany najczęściej jako µg/ml

Oporność mikrobiologiczna – oporność niskiego lub wysokiego stopnia demonstrowana fenotypowo lub genotypowo

Oporność kliniczny- sukces terapeutyczny jest niemożliwy do osiągnięcia pomimo zastosowania najwyższych( maksymalnych) dawek antybiotyku

Średnia wrażliwość – szczepy między klinicznie opornymi a wrażliwymi; sukces kliniczny może być osiągnięty przy zwiększonej dawce, częstotliwości podawania lub dłuższym okresie stosowania; konieczne oznaczenie MIC

Wrażliwość mikrobiologiczna – dany szczep nie jest w stanie przeżyć w stężeniu antybiotyku i nie posiada mechanizmów oporności

Wrażliwość kliniczna – wrażliwość na standardowe dawki

W warunkach in vitro możemy wyróżnić metody oznaczania lekowrażliwości:

1) jakościowe                        2) półilościowe                      3) jakościowe

ad.1) metoda jakościowa, czyli metoda dyfuzyjno-krążkowa

Na podłoże posiewa się czysta hodowle bakterii – zawiesina do tego służąca to zawiesina bakterii w roztworze soli fizjologicznej o gęstości 0,5 w skali McFarlanda.

Następnie na płytkę umieszcza się krążki bibułowe nasączone danym antybiotykiem o stężeniu odpowiadającemu stężeniu we krwi pacjenta. Następnie płytka inkubowana jest w cieplarce w odpowiednich warunkach i przez odpowiedni okres.

Podczas wykonywania tego oznaczenia należy kierować się zasadą 15-15-15, czyli w przeciągu do 15 min od wykonania zawiesiny należy ja posiać; w 3-15min od posiania nałożyć krążki; w 3-15 min od nałożenia krążków umieścić w cieplarce.

Wynik oznaczenia odczytywany jest jako średnica [mm] strefy całkowitego zahamowania wzrostu i porównywana jest z zakresami (dla danego gatunku bakterii i danego antybiotyku) w tabelach, następnie interpretowany jako szczep oporny (R), wrażliwy (S) lub średniowrażliwy (I).

Odczyt stref ->płytki krwawe- płytkę należy otworzyć, popatrzeć pod światło i szukać aż się znajdzie strefę zahamowania nie myląc jej przy tym z hemolizą

Płytki nie-krwawe- płytka trzymana na ciemnym tle, dobrze oświetlona, odczyt przy użyciu linijki ( lub czegoś innego co zmierzy średnicę) od tyłu płytki;

Na sam wynik wpływa: temperatura inkubacji, gęstość zawiesiny, czas nałożenia krążków, czas inkubacji, skład podłoża, stężenie antybiotyku podłoża, czas od wykonania zawiesiny do posiewu

obraz 2023 05 21 211336228

ad. 2) metody półilościowe, czyli metoda automatyczna – wykonane przez urządzenie (np. VITEK)

Wykonywane są 2-4 rozcieńczeń danego antybiotyku (stężenia krytyczne) , następnie dodawana jest zawiesina bakteryjna o określonej gęstości. Po kilkugodzinnej inkubacji wzrost bakterii oceniany jest metodą turbidymetryczną (ocena stopnia zmętnienia). Wyniki są opracowywane i opatrywane komentarzem przez system komputerowy. Samo MIC jest wyliczone z algorytmów, wyniki są ekstrapolowane. Wynik w formie interpretacji (S,I,R) i zakresu stężeń (MIC).

ad. 3) metody ilościowe pozwalają na wyznaczenie MIC. Stosuje się je gdy:

  • Oznaczenie metodą jakościowa jest mało wiarygodne
  • Oczekujemy zmiany farmakokinetyki leku (niewydolność nerek lub wątroby)
  • Gdy istnieją wskazania do użycia optymalnego leku z kilku możliwych do zastosowania (np. gdy pacjent jest uczulony na któryś lek)
  • Mamy do czynienia z krytycznym, ciężkim, inwazyjnym, trudnym do leczenia zakażeniem

Metody:

  1. Dyfuzji z paska np. E-test

Zasada i wykonanie: Na podłoże z posianymi badanymi bakteriami umieszczany jest pasek plastikowy z podziałką, na którym znajduje się gradient stężeń antybiotyku [µg/ml]. Po nałożeniu na podłoże antybiotyk zaczyna dyfundować do podłoża.

Wynik odczytuje się w miejscu przecięcia podziałki paska przez elipsę strefy zahamowania wzrostu bakterii i jest to najmniejsze stężenie hamujące.

2. Seryjnych rozcieńczeń – mogą być wykonywane w podłożu stałym lub płynnym

Zasada i wykonanie:

  • Stałe podłoże – antybiotyk obecny w podłożu agarowym w malejących stężeniach ( jedno stężenie na jednej płytce)

Następnie na taka płytkę posiewa się zawiesiną bakteryjną o określonej gęstości adekwatnej do danego stężenia. Wynik określony na podstawie tego, na której płytce (z jakim najmniejszym stężeniem) nie wyrosły kolonie.

  • Płynne podłoża – wyróżniamy metody mikro- i makro- rozcieńczeń

Makrorozcienczeń – przeprowadzana w probówkach zawierających po 2 ml bulionu z antybiotykiem i  z dodatkiem zawiesiny bakteryjnej określonej gęstości inokulum. Probówki zawierają antybiotyk o malejącym stężeniu ( zazwyczaj wykonane przez podwójne rozcieńczenia)

Mikrorozcieńczeń – przeprowadzana w studzienkach na płytkach titracyjnych, które zawierają po 100 µl bulionu z antybiotykiem z dodatkiem zawiesiny bakteryjnej.  Stężenia antybiotyku są malejące w kolejnych studzienkach.

Odczyt MIC na podstawie oceny zmętnienia (np. metodą turbidymetryczna lub oceną wzrokową) bulionów z odpowiednimi stężeniami antybiotykami (po odpowiednim czasie i warunkach inkubacji).

Bibliografia:

  1. Ministerstwo Zdrowia, “Narodowy program ochrony antybiotyków na lata 2016-2020,” 2016
  2. Żabicka D, Literacka E, Bojarska K. “MDR, XDR, PDR – jednolite, międznarodowe definicje nabytej oporności drobnoustrojów na antybiotyki,” Biuletyn Narodowego Programu Ochrony Antybiotyków, 2012
  3. Nikonorow E, Baraniak A, Gniadkowski M. “Oporność bakterii z rodziny Enterobacteriaceae na antybiotyki β-laktamowe wyniķajaca z wytwarzania β-laktamaz,” Postępy Mikrobiol., vol. 52, no. 3, pp. 261–271, 2013

Autor: mgr Agnieszka Góra, diagnosta laboratoryjny

Oceń ten post
Subscribe
Powiadom o
guest

Witryna wykorzystuje Akismet, aby ograniczyć spam. Dowiedz się więcej jak przetwarzane są dane komentarzy.

1 Komentarz
najstarszy
najnowszy oceniany
Inline Feedbacks
View all comments
Justyna

Fascynujący artykuł o oznaczaniu lekooporności bakterii! Pani Agnieszka w prosty i zrozumiały sposób przedstawia procesy, metody i wyzwania związane z badaniem lekooporności bakterii.

1
0
Masz przemyślenia? Napisz komentarz!x