Oznaczanie lekowrażliwości bakterii

Jednym z najistotniejszych problemów medycyny XXI wieku jest narastająca oporność na leki przeciwdrobnoustrojowe wśród wielu powszechnie występujących gatunków bakterii. Jest to zjawisko coraz bardziej niepokojące, gdyż lekooporne szczepy bakteryjne są izolowane zarówno z zakażeń szpitalnych, jak i pozaszpitalnych, co stanowi poważny problem diagnostyczny, terapeutyczny oraz epidemiologiczny. Przypuszcza się, że w 2050 roku lekooporność bakterii będzie główną przyczyną zgonów, a ich liczba może sięgać nawet 10 milionów rocznie. Nadużywanie leków przeciwbakteryjnych, jak również ich niewłaściwe stosowanie w medycynie, rolnictwie i przemyśle to podstawowe czynniki odpowiedzialne za rozwój i szerzenie się lekooporności na całym świecie. Wg aktualnych danych dot. konsumpcji antybiotyków w krajach Unii Europejskiej, w 2016r. przeciętny poziom zużycia antybiotyków w środowisku pozaszpitalnym (lecznictwo otwarte) w Polsce wynosił 24 DDD (ang. defined daily dose, dawka dobowa definiowana) na 1000 mieszkańców na dzień i był wyższy od średniej europejskiej. W środowisku szpitalnym (lecznictwo zamknięte) przeciętna konsumpcja antybiotyków kształtowała się na niższym niż średnia europejska poziomie wynoszącym 1,36 DDD na 1000 mieszkańców na dzień. Leki przeciwbakteryjne są także powszechnie stosowane w hodowlach zwierząt – kontrola NIK (Najwyższa Izba Kontroli) wykazała, że aż 70% hodowców w woj. lubuskim stosowało antybiotyki w nieuzasadnionych przypadkach leczniczych.

Terapia zakażeń wywoływanych przez szczepy lekooporne staje się coraz bardziej nieskuteczna. Obserwuje się znaczącą dysproporcję pomiędzy dynamiką narastania tego zjawiska a możliwościami pozyskiwania nowych, skutecznych opcji terapeutycznych wobec wielolekoopornych drobnoustrojów. Pod wpływem presji antybiotykowej dochodzi do selekcji szczepów bakterii opornych na wiele dotąd stosowanych antybiotyków i chemioterapeutyków.

Za szczepy wielolekooporne (ang. multidrug- resistance, MDR) uważa się drobnoustroje wykazujące oporność na co najmniej jeden lek z trzech lub więcej grup związków przeciwbakteryjnych mających zastosowanie wobec danego gatunku bakterii. Drobnoustroje mogą być także klasyfikowane jako szczepy
o rozszerzonej oporności (ang. extensively drug resistant, XDR) wrażliwe maksymalnie
na dwie grupy antybiotyków stosowanych w danym wskazaniu, a także jako szczepy oporne na wszystkie leki ze wszystkich grup (ang. pandrug-resistance, PDR) stosowanych w terapii zakażeń.

Ryzyko nastania ery post-antybiotykowej jest realne i stanowi ogromne wyzwanie dla ludzkości. Mając na uwadze powyższe dane, zjawisko szerzącej się antybiotykooporności określane jest jako jeden z najwyższych priorytetów zdrowia publicznego. Powstało wiele strategii przeciwdziałających rozwijaniu się oporności bakteryjnej przygotowanych m.in. przez Światową Organizację Zdrowia (ang. World Health Organization, WHO), amerykańskie Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (ang. Centers for Disease Control and Prevention, CDC), Europejskie Centrum Profilaktyki i Kontroli Zakażeń (ang. European
Centre for Disease Prevention and Control, ECDC), a także przez polskie Ministerstwo Zdrowia poprzez utworzenie Narodowego Programu Ochrony Antybiotyków (NPOA). Projekty te polegają na promowaniu zasad racjonalnej antybiotykoterapii, skoordynowanym nadzorze nad zakażeniami wywołanymi przez szczepy wielooporne, a także na wspieraniu projektów badawczych w poszukiwaniu nowych związków przeciwbakteryjnych. Należy podkreślić, że współczesna medycyna musi zająć się problemem szczepów MDR w ten sam sposób jak profilaktyką HIV lub malarii.

Cel oznaczania lekowrażliwości

a) w celu wprowadzenia terapii celowanej, czyli opartej na wyniku oznaczenia lekowrażliwości – popartej dowodami, ze dany szczep jest faktycznie wrażliwy na ten lek

b) wśród bakterii występuje bardzo duża zmienność w zakresie wrażliwości/oporności na leki

c) bakterie mogą wykształcać mechanizmy oporności przeciwko powszechnie stosowanym antybiotykom/chemioterapeutykom(np. na skutek wymiany plazmidów z inną bakterią)

Oporność na leki związana z wytwarzaniem enzymów

Spośród wielu strategii oporności na związki przeciwbakteryjne można wyróżnić inaktywację enzymatyczną w wyniku wytwarzania enzymów katalizujących reakcje hydrolizy bądź modyfikacji stosowanych antybiotyków oraz chemioterapeutyków. Antybiotyki β-laktamowe to grupa leków często stosowanych w terapii zakażeń bakteryjnych, jednak z uwagi na zjawisko narastającej oporności mogą okazać się one nieskuteczne. Mechanizmem o największym znaczeniu dla oporności na β-laktamy
u bakterii Gram-ujemnych jest wytwarzanie enzymów – β-laktamaz odpowiedzialnych za hydrolizę wiązania amidowego w cząsteczce leku. Większość drobnoustrojów posiada własne, gatunkowo specyficzne β-laktamazy, natomiast wśród poszczególnych szczepów danego gatunku coraz częściej występuje oporność nabyta, która jest związana ze zmianami genetycznymi w bakteryjnym genomie. Zakres i stopień oporności danego szczepu na β-laktamy jest uwarunkowany rodzajem oraz poziomem ekspresji wytwarzanych przez bakterię β-laktamaz. Enzymy te mogą być wytwarzane przez komórkę bakteryjną na stałym poziomie (ekspresja konstytutywna) bądź w sposób regulowany, zależny od obecności induktora (ekspresja indukowana). W wyniku mutacji w genach regulatorowych proces syntezy β- laktamaz o charakterze indukowanym może przebiegać na wysokim poziomie przez cały czas, bez względu na obecność induktora. Zjawisko to określa się mianem derepresji i może ono prowadzić do selekcji szczepów bakteryjnych opornych na wszystkie grupy β-laktamów. β-laktamazy są klasyfikowane m.in. według dwóch systemów: funkcjonalnego oraz strukturalnego. System funkcjonalny, zaproponowany przez Bush i Jacoby’ego, uwzględnia spektrum substratowe β-laktamaz oraz ich podatność na hamowanie przez inhibitory β-laktamowe (kwas klawulanowy, sulbaktam oraz tazobaktam) oraz EDTA i NaCl. Natomiast podział strukturalny autorstwa Amblera jest utworzony w oparciu o analizę sekwencji nukleotydowych enzymów i grupuje je na cztery klasy oznaczone literami alfabetu: A, B, C, D. Klasa A obejmuje penicylinazy – β-laktamazy serynowe podatne na hamowanie przez inhibitory, hydrolizujące głównie penicyliny i cefalosporyny I generacji (np. klasyczne enzymy TEM-1, SHV-1), a także dodatkowo cefalosporyny III generacji lub karbapenemy. Klasa B to metalo-β-laktamazy (MBL) zawierające jony cynku w centrum aktywnym, a ich zakres substratowy obejmuje
wszystkie antybiotyki β-laktamowe oprócz aztreonamu. Są one hamowane m.in. przez czynniki kompleksujące kationy metali (np. EDTA). Wśród najistotniejszych klinicznie rodzin enzymów tej klasy można wyróżnić: IMP (ang. imipenemase metallo- β- lactamase), VIM (ang. Verona integron-encoded metallo- β- lactamase) oraz NDM (ang. New Delhi metallo-β-lactamase). Do klasy C należą cefalosporynazy – β- laktamazy serynowe preferujące cefalosporyny, ale aktywne także względem
penicylin i monobaktamów. Są niewrażliwe na działanie inhibitorów. Głównymi przedstawicielami tej klasy są enzymy AmpC. Klasa D obejmuje oksacyklinazy (OXA) – grupę enzymów o szerokim spektrum substratowym obejmującym penicyliny (w tym oksacylinę w odróżnieniu od penicylinaz), a niektóre warianty unieczynniają dodatkowo karbapenemy lub cefalosporyny. Nie ulegają one hamowaniu przez inhibitory β-laktamowe.

W odpowiedzi na wprowadzenie do lecznictwa kolejnych rodzajów i generacji
antybiotyków β-laktamowych, nastąpił intensywny proces ewolucji β-laktamaz.
Na całym świecie pojawiły się nowe enzymy określane jako β-laktamazy o rozszerzonym
spektrum substratowym ESβL (ang. extended spectrum β-lactamase) oraz
karbapenemazy, których zakres działania obejmuje zdecydowaną większość β- laktamów.
Wykrywane u bakterii enzymy ESβL są zdolne do hydrolizy penicylin,
monobaktamów oraz cefalosporyn (z wyjątkiem cefamycyn). Wiele z nich może być
podatna na inhibicję kwasem klawulanowym, tazobaktamem bądź sulbaktamem. Są one
wytwarzane de novo lub powstają w wyniku mutacji punktowych w genach kodujących
inne β-laktamazy. Wg klasyfikacji Amblera ESβL należą do klasy A (m.in. rodziny
CTX- M, SHV, TEM, VEB, PER) oraz klasy D (np. OXA-11, OXA-16).
Karbapenemy to β-laktamy stosowane w terapii ciężkich zakażeń wywołanych przez
lekooporne pałeczki Gram-ujemne, a wielu sytuacjach są traktowane jako leki ostatniej
szansy. Jednak w ciągu ostatnich lat obserwuje się wzrost odsetka szczepów opornych na
tę grupę leków, który wynika przede wszystkim ze zdolności wytwarzania enzymów –
karbapenemaz. Wśród pałeczek Gram-ujemnych najczęściej izolowane są
karbapenemazy takie jak:
– KPC (ang. Klebsiella pneumoniae carbapenemase) – należące do klasy A
wg Amblera; wykazują właściwości hydrolityczne wobec wszystkich grup
antybiotyków β-laktamowych,
– MBL – reprezentujące klasę B, nierozkładające tylko monobaktamów,
– CHDL (ang. carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase) – ich zakres
substratowy obejmuje nie tylko karbapenemy, lecz również penicyliny
i cefalosporyny I generacji; reprezentowane m.in. przez OXA-48, OXA-51,
OXA-23, OXA-58, OXA-40.

Modyfikacja enzymatyczna jest również głównym mechanizmem oporności na inne
grupy leków – aminoglikozydy oraz chloramfenikol. Pałeczki Gram-ujemne wytwarzają
enzymy modyfikujące aminoglikozydy – AME (ang. aminoglycoside-modifying
enzyme), do których zaliczane są nukleotydotransferazy ANT (ang. aminoglycoside
nucleotidyltransferase), fosfotransferazy APH (ang.aminoglycoside phosphotransferase)
oraz acetylotransferazy AAC (ang. aminoglycoside acetyltransferase). Z kolei oporność
na chloramfenikol wynika z ekspresji acetylotransferazy CAT (ang. chloramphenicol
acetyltransferases) inaktywującej cząsteczkę tego antybiotyku.

Oporność nieenzymatyczna

Oporność szczepów bakteryjnych na różne grupy leków warunkują także
mechanizmy nieenzymatyczne, do których zaliczane są: zmniejszona przepuszczalność
błony zewnętrznej, aktywny wyrzut leków przez pompy błonowe (ang. efflux pumps),
zmiany w miejscu docelowego działania leku oraz wytwarzanie biofilmu.
Za przepuszczalność osłon komórkowych bakterii Gram-ujemnych odpowiedzialne
są m.in. obecne w błonie białka porynowe tworzące kanały transportowe dla różnych
substancji, w tym antybiotyków i chemioterapeutyków, do wnętrza komórki.
Powstawanie oporności na różne grupy związków, może wynikać ze zmian w błonie
zewnętrznej i polega m.in. na zmniejszeniu poziomu ekspresji białek porynowych,
zmianach w ich budowie lub funkcji.
Aktywne usuwanie z komórki bakteryjnej różnego typu toksycznych substancji przez
pompy błonowe determinuje oporność na leki wśród wielu istotnych klinicznie gatunków
drobnoustrojów. Pompy te wykazują różne powinowactwo do substratów
– mogą transportować konkretny rodzaj substancji bądź wiele różnych grup związków.
Dotychczas poznane systemy pomp reprezentują pięć rodzin: MFS (ang. major facilitator
superfamily), SMR (ang. small multidrug resistance family), MATE (ang. multidrug and
toxic compound extrusion family), ABC (ang. ATP binding cassette superfamily) i RND
(ang. resistance-nodulation-cell division family). Najbardziej rozpowszechnione wśród
pałeczek Gram- ujemnych są pompy błonowe z rodziny RND (m.in. AcrAB-TolC
i MexAB-OprM).
Kolejnym mechanizmem warunkującym lekooporność są zmiany w miejscu
docelowym działania leku. Mogą one powstawać wg dwóch schematów. Pierwszy z nich
zachodzi na drodze mutacji w genach kodujących pożądany punkt uchwytu, powodując
ekspresję zmienionego białka pozbawionego zdolności łączenia się z cząsteczką leku.
Drugi schemat modyfikowania miejsca docelowego wiązania leku polega na ekspresji
białek protekcyjnych zapobiegających łączeniu się cząsteczki związku
przeciwbakteryjnego z punktem uchwytu. Obydwa typy zmian mogą mieć
udział w przypadku oporności na chinolony oraz fluorochinolony. W chromosomie
bakteryjnym powstają mutacje w genach gyr i/lub par, odpowiedzialnych za syntezę
gyrazy DNA oraz topoizomerazy IV – miejsca wiązania tych chemioterapeutyków,
wskutek czego leki stają się nieskuteczne. Region chromosomu, w którym powstają
te zmiany nazywany jest obszarem warunkującym oporność na chinolony
(ang. quinolone resistance-determining region, QRDR). Lekooporne szczepy

bakteryjne mogą również wytwarzać białka Qnr, blokujące powstawanie kompleksu
fluorochinolon-enzym-DNA.
Modyfikacja miejsca docelowego działania antybiotyku związana jest również
z opornością na polimyksyny. Związki te charakteryzują się powinowactwem
do składnika błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych – lipopolisacharydu (LPS).
Powierzchniowy ładunek LPS może ulec obniżeniu w wyniku zmian w strukturze
lipidu A, co skutkuje brakiem punktu uchwytu dla tych antybiotyków na powierzchni
komórki bakteryjnej.
Jednym z intensywnie badanych mechanizmów lekooporności jest zdolność
do tworzenia biofilmu. Jest to złożona struktura utworzona z komórek drobnoustrojów
jednego lub kilku gatunków bakterii otoczonych warstwą zewnątrzkomórkowej
macierzy. Stanowi ona istotny czynnik determinujący chorobotwórczość, szczególnie
w środowisku szpitalnym, ze względu na możliwość jego rozwoju zarówno
na powierzchniach biotycznych, jak i abiotycznych – materiałach oraz sprzęcie
medycznym takim jak rurki dotchawicze bądź różnego typu cewniki. Bakterie rosnące
w postaci biofilmu wykazują zmniejszoną wrażliwość na działanie środków
przeciwdrobnoustrojowych. Wykazano związek pomiędzy zdolnością wytwarzania
biofilmu przez szczepy bakteryjne a opornością na różne grupy antybiotyków, jednak
nie zaobserwowano zwiększonej produkcji macierzy u szczepów MDR.

Podstawowe terminy

Antybiogram – oznaczenie lekowrażliwości; może być podstawowy (obejmuje podstawowe, najczęściej używane antybiotyki) lub rozszerzony (oznaczanie lekowrażliwości na leki rzadziej używane, bardziej specyficzne)

MIC – najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii w warunkach In vitro, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. Wyrażany najczęściej jako µg/ml

Oporność mikrobiologiczna – oporność niskiego lub wysokiego stopnia demonstrowana fenotypowo lub genotypowo

Oporność kliniczny- sukces terapeutyczny jest niemożliwy do osiągnięcia pomimo zastosowania najwyższych( maksymalnych) dawek antybiotyku

Średnia wrażliwość – szczepy między klinicznie opornymi a wrażliwymi; sukces kliniczny może być osiągnięty przy zwiększonej dawce, częstotliwości podawania lub dłuższym okresie stosowania; konieczne oznaczenie MIC

Wrażliwość mikrobiologiczna – dany szczep nie jest w stanie przeżyć w stężeniu antybiotyku i nie posiada mechanizmów oporności

Wrażliwość kliniczna – wrażliwość na standardowe dawki

W warunkach in vitro możemy wyróżnić metody oznaczania lekowrażliwości:

1) jakościowe                        2) półilościowe                      3) jakościowe

ad.1) metoda jakościowa, czyli metoda dyfuzyjno-krążkowa

Na podłoże posiewa się czysta hodowle bakterii – zawiesina do tego służąca to zawiesina bakterii w roztworze soli fizjologicznej o gęstości 0,5 w skali McFarlanda.

Następnie na płytkę umieszcza się krążki bibułowe nasączone danym antybiotykiem o stężeniu odpowiadającemu stężeniu we krwi pacjenta. Następnie płytka inkubowana jest w cieplarce w odpowiednich warunkach i przez odpowiedni okres.

Podczas wykonywania tego oznaczenia należy kierować się zasadą 15-15-15, czyli w przeciągu do 15 min od wykonania zawiesiny należy ja posiać; w 3-15min od posiania nałożyć krążki; w 3-15 min od nałożenia krążków umieścić w cieplarce.

Wynik oznaczenia odczytywany jest jako średnica [mm] strefy całkowitego zahamowania wzrostu i porównywana jest z zakresami (dla danego gatunku bakterii i danego antybiotyku) w tabelach, następnie interpretowany jako szczep oporny (R), wrażliwy (S) lub średniowrażliwy (I).

Odczyt stref ->płytki krwawe- płytkę należy otworzyć, popatrzeć pod światło i szukać aż się znajdzie strefę zahamowania nie myląc jej przy tym z hemolizą

Płytki nie-krwawe- płytka trzymana na ciemnym tle, dobrze oświetlona, odczyt przy użyciu linijki ( lub czegoś innego co zmierzy średnicę) od tyłu płytki;

Na sam wynik wpływa: temperatura inkubacji, gęstość zawiesiny, czas nałożenia krążków, czas inkubacji, skład podłoża, stężenie antybiotyku podłoża, czas od wykonania zawiesiny do posiewu

ad. 2) metody półilościowe, czyli metoda automatyczna – wykonane przez urządzenie (np. VITEK)

Wykonywane są 2-4 rozcieńczeń danego antybiotyku (stężenia krytyczne) , następnie dodawana jest zawiesina bakteryjna o określonej gęstości. Po kilkugodzinnej inkubacji wzrost bakterii oceniany jest metodą turbidymetryczną (ocena stopnia zmętnienia). Wyniki są opracowywane i opatrywane komentarzem przez system komputerowy. Samo MIC jest wyliczone z algorytmów, wyniki są ekstrapolowane. Wynik w formie interpretacji (S,I,R) i zakresu stężeń (MIC).

ad. 3) metody ilościowe pozwalają na wyznaczenie MIC. Stosuje się je gdy:

• Oznaczenie metodą jakościowa jest mało wiarygodne
• Oczekujemy zmiany farmakokinetyki leku (niewydolność nerek lub wątroby)
• Gdy istnieją wskazania do użycia optymalnego leku z kilku możliwych do zastosowania (np. gdy pacjent jest uczulony na któryś lek)
• Mamy do czynienia z krytycznym, ciężkim, inwazyjnym, trudnym do leczenia zakażeniem

Metody:

1. Dyfuzji z paska np. E-test

Zasada i wykonanie: Na podłoże z posianymi badanymi bakteriami umieszczany jest pasek plastikowy z podziałką, na którym znajduje się gradient stężeń antybiotyku [µg/ml]. Po nałożeniu na podłoże antybiotyk zaczyna dyfundować do podłoża.

Wynik odczytuje się w miejscu przecięcia podziałki paska przez elipsę strefy zahamowania wzrostu bakterii i jest to najmniejsze stężenie hamujące.

2. Seryjnych rozcieńczeń – mogą być wykonywane w podłożu stałym lub płynnym

Zasada i wykonanie:

• Stałe podłoże – antybiotyk obecny w podłożu agarowym w malejących stężeniach ( jedno stężenie na jednej płytce)

Następnie na taka płytkę posiewa się zawiesiną bakteryjną o określonej gęstości adekwatnej do danego stężenia. Wynik określony na podstawie tego, na której płytce (z jakim najmniejszym stężeniem) nie wyrosły kolonie.

• Płynne podłoża – wyróżniamy metody mikro- i makro- rozcieńczeń

Makrorozcienczeń – przeprowadzana w probówkach zawierających po 2 ml bulionu z antybiotykiem i  z dodatkiem zawiesiny bakteryjnej określonej gęstości inokulum. Probówki zawierają antybiotyk o malejącym stężeniu ( zazwyczaj wykonane przez podwójne rozcieńczenia)

Mikrorozcieńczeń – przeprowadzana w studzienkach na płytkach titracyjnych, które zawierają po 100 µl bulionu z antybiotykiem z dodatkiem zawiesiny bakteryjnej.  Stężenia antybiotyku są malejące w kolejnych studzienkach.

Odczyt MIC na podstawie oceny zmętnienia (np. metodą turbidymetryczna lub oceną wzrokową) bulionów z odpowiednimi stężeniami antybiotykami (po odpowiednim czasie i warunkach inkubacji).

Bibliografia:

1. Ministerstwo Zdrowia, “Narodowy program ochrony antybiotyków na lata 2016-2020,” 2016
2. Żabicka D, Literacka E, Bojarska K. “MDR, XDR, PDR – jednolite, międznarodowe definicje nabytej oporności drobnoustrojów na antybiotyki,” Biuletyn Narodowego Programu Ochrony Antybiotyków, 2012
3. Nikonorow E, Baraniak A, Gniadkowski M. “Oporność bakterii z rodziny Enterobacteriaceae na antybiotyki β-laktamowe wyniķajaca z wytwarzania β-laktamaz,” Postępy Mikrobiol., vol. 52, no. 3, pp. 261–271, 2013

Autor: mgr Agnieszka Góra, diagnosta laboratoryjny