Wstęp

Współczesna medycyna transplantacyjna i transfuzjologia opierają się na ciągłej dostępności bezpiecznych oraz funkcjonalnych składników krwi. Standardowe metody konserwacji w stanie płynnym (hipotermia) nakładają jednak nienegocjowalne ograniczenia czasowe, wynikające z postępującego starzenia się komórek. Rozwiązaniem tego problemu jest kriokonserwacja – zaawansowana metoda długoterminowego przechowywania wybranych składników komórkowych w temperaturach kriogenicznych.

Głównym celem implementacji systemów kriogenicznych w publicznej służbie krwi jest zabezpieczenie logistyczne pacjentów wymagających rzadkich fenotypów grup krwi (np. Bombay, Rhnull czy kombinacji wielokrotnych przeciwciał), w przypadku których znalezienie aktywnego dawcy w trybie pilnym graniczy z niemożliwością. Metoda ta stanowi również kluczowy element strategii obronnych i zarządzania kryzysowego, umożliwiając tworzenie rezerw strategicznych na wypadek katastrof masowych, konfliktów zbrojnych czy nagłych kryzysów epidemicznych. Dzięki obniżeniu temperatury poniżej punktów krytycznych dla metabolizmu, kriokonserwacja zatrzymuje zegar biologiczny komórek, otwierając nowe możliwości spersonalizowanej hemoterapii.

1. Podstawy kriokonserwacji składników krwi

Podczas przechowywania składników krwi w stanie płynnym zachodzą stopniowe zmiany biochemiczne i funkcjonalne, określane jako zmiany magazynowania (ang. storage lesion). Zmiany te obejmują m.in. spadek stężenia 2,3-difosfoglicerynianu (2,3-DPG) oraz adenozynotrifosforanu (ATP), hemolizę, wyciek potasu z wnętrza komórek oraz narastanie stresu oksydacyjnego.

Standardowo KKCz/RW ubogoleukocytarny KKCz (UKKCz) przechowuje się w temperaturze 2–6°C przez maksymalnie 42 dni. Z kolei koncentraty krwinek płytkowych (KKP) przechowuje się w temperaturze 20–24°C przy ciągłym mieszaniu; ich podstawowy okres przydatności wynosi 5 dni (może zostać wydłużony do 7 dni pod warunkiem wykonania badań wykluczających skażenie mikrobiologiczne).

Obniżenie temperatury do wartości kriogenicznych znacząco spowalnia procesy metaboliczne, jednak samo zamrażanie bez optymalizacji technologicznej jest letalne dla komórek. Negatywny wpływ mają m.in. tworzenie się wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych kryształów lodu, drastyczne zmiany stężenia substancji rozpuszczonych w fazie niezeszklonej (efekt roztworu), stres osmotyczny, odwodnienie komórek oraz niewłaściwa szybkość chłodzenia i ogrzewania. Z tego względu proces kriokonserwacji wymaga zastosowania odpowiedniego krioprotektanta oraz ściśle kontrolowanych warunków technologicznych.

2. Mechanizmy krioprotekcji i stosowane środki kriochronne

2.1. Erytrocyty — glicerol

Glicerol jest przenikającym krioprotektantem stosowanym w kriokonserwacji erytrocytów. Ogranicza on uszkodzenia komórek podczas zamrażania i rozmrażania, wpływając m.in. na temperaturę zamarzania oraz zmiany osmotyczne. Skuteczność ochrony zależy od stężenia glicerolu, szybkości chłodzenia, temperatury przechowywania oraz sposobu usuwania krioprotektanta po rozmrożeniu.

W praktyce stosuje się dwie metody:

• Metoda niskiego stężenia: zwykle około 20% (m/v, w/v)
• Metoda wysokiego stężenia: zwykle około 40% (m/v, w/v)

Wybór jednej z tych metod determinuje konieczność wdrożenia odmiennych technik zamrażania i rozmrażania oraz użycia innego typu aparatury.

2.2. Trombocyty — dimetylosulfotlenek (DMSO)

W kriokonserwacji płytek krwi jako krioprotektant stosuje się dimetylosulfotlenek (DMSO; ang. dimethyl sulfoxide). W literaturze opisano procedury wykorzystujące stężenie około 5%, przy czym dokładna wartość oraz sposób dodawania DMSO zależą od przyjętej metodologii. W niektórych protokołach po dodaniu krioprotektanta płytki są zagęszczane, a większość supernatantu zawierającego DMSO jest usuwana jeszcze przed zamrożeniem.

Żadnej wartości stężenia ani schematu przygotowania nie należy traktować jako uniwersalnego standardu. Zastosowany protokół musi precyzyjnie określać warunki dodawania krioprotektanta, zamrażania, przechowywania, rozmrażania oraz rekonstytucji.

3. Kriokonserwacja ubogoleukocytarnego koncentratu krwinek czerwonych (UKKCz)

3.1. Przygotowanie materiału i glicerolizacja

Materiał wyjściowy stanowi KKCz uzyskany z krwi pełnej pobranej do płynów konserwujących CPD lub CPDA-1, przechowywany w temperaturze 2–6°C nie dłużej niż przez 7 dni. Składnik ten należy przefiltrować w celu uzyskania UKKCz.

Glicerol introduce się do koncentratu w warunkach kontrolowanego mieszania, aby zminimalizować gwałtowne zmiany osmotyczne. Kolejność dodawania, tempo wprowadzania, czas wyrównywania stężeń, proporcje objętościowe oraz ewentualne etapy wirowania zależą od używanego systemu. W praktyce operacyjnej parametry te muszą wynikać bezpośrednio z zatwierdzonej i zwalidowanej procedury produkcyjnej, zgodnej z aktualnymi standardami krajowymi.

3.2. Zamrażanie i warunki przechowywania

Po zakończeniu glicerolizacji składnik umieszcza się w specjalnych metalowych osłonach. Do zamrażania wykorzystuje się urządzenia z kontrolowaną prędkością chłodzenia lub specjalistyczny sprzęt chłodniczy.

Metody niskiego i wysokiego stężenia glicerolu różnią się warunkami chłodzenia oraz przechowywania:

• Metoda niskiego stężenia: zaleca się wykonywanie wszystkich czynności w systemie zamkniętym.
• Metoda wysokiego stężenia: wymaga użycia specjalistycznego sprzętu i gotowych, certyfikowanych odczynników do glicerolizacji.

3.3. Rozmrażanie i deglicerolizacja

Technika rozmrażania krwinek czerwonych jest ściśle powiązana z zastosowaną metodą zamrażania. Wymaga ona użycia specjalistycznych roztworów płuczących (np,NaCl), dobranych do zastosowanych odczynników krioochronnych. Zaleca się prowadzenie tego procesu w systemie zamkniętym.

Przed transfuzją UKKCz musi zostać poddany deglicerolizacji w celu usunięcia glicerolu i przywrócenia parametrów jakościowych wymaganych dla produktu leczniczego. W zależności od wybranej metody proces ten może obejmować:

1. Zagęszczanie składnika i usuwanie supernatantu.
2. Płukanie w roztworach o odpowiednim gradiencie osmotycznym.
3. Etapy płukania izotonicznego.
4. Zawieszenie erytrocytów w dopuszczonym płynie końcowym.

Procedurę można przeprowadzić ręcznie lub w sposób zautomatyzowany. Szczegółowe parametry, takie jak stężenia NaCl, objętości płynów, szybkość przepływu, siła i czas wirowania oraz końcowa objętość produktu, muszą być ściśle określone w zwalidowanym protokole.

3.4. Charakterystyka produktu po deglicerolizacji

Deglicerolizacja znacząco obniża zawartość glicerolu oraz pozwala na usunięcie większości pozostałości osocza i innych składników komórkowych. Rzeczywisty skład końcowego preparatu zależy od metody przygotowania, stopnia leukoredukcji oraz efektywności etapów płukania.

4. Kriokonserwacja koncentratu krwinek płytkowych (KKP)

4.1. Zamrażanie i przechowywanie

Kriokonserwacja płytek krwi wymaga odrębnego postępowania ze względu na ich specyficzne właściwości biologiczne i dużą wrażliwość na czynniki zewnętrzne. Jako środek krioochronny stosuje się DMSO, którego końcowe stężenie musi wynosić 5% (v/v).

Dopuszcza się stosowanie różnych metod zamrażania KKP pod warunkiem uprzedniej walidacji procesu. Walidacja ta musi potwierdzić zachowanie parametrów życiowych i funkcjonalności krwinek in vitro oraz wykazać w badaniach in vivo prawidłowy potransfuzyjny czas przeżycia płytek w organizmie biorcy. Zamrażaniu można poddać zlewany ubogoleukocytarny KKP (zUKKP) lub UKKP uzyskany metodą aferezy (z separatora komórkowego). Procedurę zamrażania należy rozpocząć nie później niż w ciągu 24 godzin od zakończenia donacji.

Zamrożone płytki (MUKKP) należy przechowywać w temperaturze poniżej -80°C. Czas przechowywania zależy od temperatury:

4.2. Rozmrażanie i rekonstytucja

Rozmrażanie i rekonstytucję płytek przeprowadza się według ściśle określonej procedury. Najczęściej stosuje się w tym celu 0,9% roztwór NaCl z dodatkiem witaminy C. Użycie innych technik jest dopuszczalne wyłącznie po walidacji procesu oceniającej czas przeżycia krwinek płytkowych u biorcy.

Po rozmrożeniu i rekonstytucji UKKP powinien być przetoczony niezwłocznie. Termin ważności tak przygotowanego składnika wynosi zaledwie 2 godziny od momentu zakończenia preparatyki.

5. Ocena jakości i wskaźnik CCI

Badania kontroli jakości należy obowiązkowo przeprowadzić zarówno przed zamrożeniem składnika, jak i po jego rozmrożeniu.

Skorygowany przyrost liczby płytek (CCI, ang. Corrected Count Increment) to wskaźnik służący do oceny skuteczności klinicznej transfuzji trombocytów. Oblicza się go w określonych punktach czasowych po przetoczeniu. Transfuzję uznaje się za skuteczną, jeśli wskaźnik wynosi:

• co najmniej 10 × 10⁹/l – po 1 godzinie od zakończenia przetoczenia,
• co najmniej 5 × 10⁹/l – po 24 godzinach od zakończenia przetoczenia.

6. Podsumowanie

Kriokonserwacja umożliwia długoterminowe przechowywanie wybranych komórkowych składników krwi, stanowiąc kluczowe narzędzie w zabezpieczaniu rzadkich fenotypów erytrocytów oraz tworzeniu interwencyjnych zapasów płytek krwi. Sukces procedury zależy od precyzyjnego doboru krioprotektantów (glicerolu dla krwinek czerwonych oraz DMSO dla płytek) oraz ścisłego przestrzegania zwalidowanych reżimów temperaturowych i czasowych.

mgr. Izabela Katroń-Kamińska

Bibliografia

1. Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 23 lipca 2026 r. w sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, przechowywania, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi (Dz. Urz. Min. Zdr. 2026 poz. 55).

2. Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 28 maja 2026 r. w sprawie wymagań dobrej praktyki przechowywania i wydawania krwi dla banków krwi (Dz. Urz. Min. Zdr. 2026 poz. 42).

3. Wytyczne w zakresie leczenia krwią i jej składnikami…, red. J. Korsak, P. Radziwon, Wojskowy Instytut Medyczny, Narodowe Centrum Krwi, Warszawa.

4. Rozdział: Preparatyka krwi i jej składników, Oficjalne procedury RCKiK.

5. Żak, M., Kriokonserwacja komórkowych składników krwi…, Journal of Transfusion Medicine and Hemostasis, 2011, t. 4, nr 2, s. 85-92.

6. Malinowski, T., Nowak, A., Podstawy krioprezerwacji komórek…, Archiwum Ruj UJ, 2023.

7. Olszewski, A., Krew i jej składniki w sytuacjach kryzysowych…, Journal of Transfusion Medicine and Hemostasis, 2026, t. 19, e01526016.

8. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components, Council of Europe Publishing, Recommendation No. R (95) 5, EDQM.