Spektrofotometr UV-Vis – budowa, zasada działania, prawo Lamberta-Beera i pomiar krok po kroku
Prawo Lamberta-Beera – podstawa pomiaru
Gdy wiązka światła o natężeniu I₀ przechodzi przez roztwór, część zostaje pochłonięta, a przez próbkę przechodzi natężenie I. Stosunek T = I/I₀ to transmitancja; absorbancję definiuje się jako A = −log₁₀T. Prawo Lamberta-Beera mówi, że A = ε · l · c, gdzie ε to molowy współczynnik absorpcji (l·mol⁻¹·cm⁻¹, cecha substancji przy danej długości fali), l – droga optyczna (standardowo 1 cm), c – stężenie molowe. Absorbancja 1 oznacza, że przez próbkę przeszło 10 % światła, absorbancja 2 – tylko 1 %. Zależność jest liniowa tylko w ograniczonym zakresie: przy wysokich stężeniach cząsteczki oddziałują ze sobą, a przy dużej absorbancji na wynik wpływa światło rozproszone w przyrządzie. Dlatego pomiary planuje się tak, by A mieściło się w przedziale ok. 0,1–1,0 (nowoczesne przyrządy dwuwiązkowe pracują liniowo do 2–3).
Budowa spektrofotometru UV-Vis
| Element | Co robi | Warianty |
|---|---|---|
| Źródło światła | emituje ciągłe widmo | lampa deuterowa (UV, 190–350 nm) + halogenowa/wolframowa (Vis-NIR, 320–1100 nm); lampa ksenonowa błyskowa (cały zakres, długa żywotność, bez rozgrzewania) |
| Monochromator | wybiera długość fali | siatka dyfrakcyjna + szczeliny; szerokość pasma spektralnego 0,5–5 nm (im węższa, tym lepsza rozdzielczość, mniej światła) |
| Układ optyczny | prowadzi wiązkę | jednowiązkowy (ślepa próba, potem próbka), dwuwiązkowy (wiązka dzielona na odniesienie i próbkę – kompensuje dryf lampy), z matrycą diodową (światło białe przez próbkę, rozszczepiane za nią – całe widmo w ułamku sekundy) |
| Komora pomiarowa | mieści kuwetę | uchwyt na kuwety 10 mm, termostatowany (Peltier) do kinetyki, karuzela wielopozycyjna, stanowisko do mikroobjętości 0,5–2 µl (droga 0,05–1 mm, „nanospektrofotometr”) |
| Detektor | zamienia światło na sygnał | fotodioda krzemowa, fotopowielacz (bardzo czuły, UV), matryca fotodiod lub CCD (urządzenia z matrycą) |
| Kuwety | naczynie na próbkę | kwarcowe (UV i Vis, od 190 nm), szklane (od ok. 340 nm), polistyrenowe jednorazowe (od ok. 340 nm), PMMA i „UV-plastik” (od ok. 280 nm); objętość 3,5 ml (makro), 1 ml (półmikro), 50–100 µl (mikro) |
Osobną grupę stanowią kolorymetry i fotometry filtrowe – zamiast monochromatora mają kilka filtrów lub diod LED o stałych długościach fali; są tańsze i wystarczające do testów kolorymetrycznych (np. analiza wody) oraz pomiaru OD600, ale nie zarejestrują widma.
Do czego służy spektrofotometr UV-Vis?
| Zastosowanie | Długość fali | Jak liczyć / uwagi |
|---|---|---|
| Stężenie DNA/RNA | 260 nm (czystość: 260/280, 260/230) | A₂₆₀ = 1 ≈ 50 µg/ml dsDNA, 40 µg/ml RNA, 33 µg/ml ssDNA (droga 1 cm); A₂₆₀/A₂₈₀ ≈ 1,8 dla DNA, ≈ 2,0 dla RNA; niższe – białko lub fenol |
| Stężenie białka (bezpośrednio) | 280 nm | absorpcja tryptofanu i tyrozyny; wymaga znanego ε lub współczynnika 1 mg/ml ≈ A 1,0 (orientacyjnie); przeszkadzają kwasy nukleinowe |
| Białko – metody barwne | Bradford 595 nm, BCA 562 nm, Lowry 750 nm | krzywa wzorcowa z albuminą (BSA) w tym samym buforze |
| Gęstość hodowli bakterii (OD600) | 600 nm | to rozproszenie, nie absorpcja – wynik zależy od przyrządu; OD 1 ≈ 8×10⁸ komórek E. coli/ml (orientacyjnie); rozcieńczać powyżej OD 0,8 |
| Kinetyka enzymatyczna | np. 340 nm (NADH/NADPH), 405 nm (p-nitrofenol) | pomiar A w czasie, termostat 25 lub 37 °C; szybkość = ΔA/Δt ÷ (ε·l) |
| Stężenie barwnych związków, kompleksów, jonów (Fe, Cu, Cr, fosforany, azotany) | λmax kompleksu (np. Fe(II)-fenantrolina 510 nm) | krzywa wzorcowa z roztworów o znanym stężeniu; zakres liniowy |
| Widmo absorpcji, identyfikacja, chlorofil, barwniki | skan 200–800 nm | położenie i kształt pasm; chlorofil a 663 nm, b 645 nm w acetonie |
| Kontrola jakości leków, wody, żywności | wg monografii (farmakopea, normy) | absorbancja właściwa A(1 %, 1 cm) |
Pomiar krok po kroku
- Rozgrzej lampy 15–30 min (nie dotyczy lamp ksenonowych) – stabilizuje natężenie światła.
- Wybierz długość fali (λmax substancji – maksimum daje największą czułość i najmniejszy błąd przy drobnych odchyleniach λ).
- Dobierz kuwetę: UV poniżej 340 nm – tylko kwarc; trzymaj ją za matowe ścianki, przezroczyste wytrzyj chusteczką do optyki, usuń pęcherzyki.
- Ślepa próba: ten sam bufor/rozpuszczalnik, w tej samej kuwecie (lub z pary dopasowanej) – wyzeruj przyrząd (autozero). W przyrządzie jednowiązkowym powtarzaj zerowanie co kilkanaście pomiarów.
- Zmierz próbkę; jeśli A > 1 (lub poza zakresem liniowym przyrządu) – rozcieńcz i uwzględnij rozcieńczenie w obliczeniach; jeśli A < 0,05 – zatęż lub użyj kuwety o dłuższej drodze.
- Do oznaczeń ilościowych sporządź krzywą wzorcową (minimum 5 stężeń obejmujących zakres próbek, ten sam bufor, ta sama temperatura); sprawdź liniowość (R² ≥ 0,99) i wyznacz stężenie z równania prostej.
- Zapisz warunki: λ, szerokość szczeliny, kuwetę, temperaturę, numer serii odczynników.
Najczęstsze błędy i kontrola przyrządu
- Zła kuweta – plastik lub szkło w UV daje wysoką absorbancję tła; zarysowane lub brudne ścianki rozpraszają światło.
- Pęcherzyki, zmętnienie, osad – rozpraszanie zawyża A; roztwory mętne odwiruj lub przefiltruj (chyba że mierzysz OD600).
- Niewłaściwa ślepa próba – bufor z innego dnia, inny rozpuszczalnik, ślepa w innej kuwecie niż próbka.
- Praca poza zakresem liniowym – A powyżej ~1,5–2 w prostych przyrządach to już strefa światła rozproszonego; wynik jest zaniżony.
- Zmiana pH lub temperatury – przesuwa widma wielu barwników i białek; mierz w tych samych warunkach co wzorce.
- Fotodegradacja i parowanie w mikroobjętościach – mierz od razu po naniesieniu kropli.
Sprawdzanie przyrządu: dokładność długości fali – filtr z tlenku holmu lub linie lampy deuterowej (486,0 i 656,1 nm); dokładność fotometryczna – roztwór dichromianu potasu w kwasie nadchlorowym (znane A przy 235, 257, 313, 350 nm) lub filtry szare z certyfikatem; światło rozproszone – roztwór KCl przy 200 nm lub NaI przy 220 nm; szum i dryf linii bazowej. W laboratoriach akredytowanych wykonuje się to okresowo i zapisuje w karcie urządzenia; wzorce z certyfikatem (CRM) dostarczają producenci i NIST.
Jak wybrać spektrofotometr?
- Zakres: tylko Vis (320–1000 nm) do kolorymetrii i OD600 – tańszy, lampa halogenowa; UV-Vis (190–1100 nm) do DNA, białek, kinetyki i widm.
- Układ: jednowiązkowy wystarcza do rutyny; dwuwiązkowy – do pomiarów długich (kinetyka, skanowanie) i wysokich absorbancji; matryca diodowa – gdy liczy się szybkość pełnych widm.
- Szerokość pasma: ≤ 2 nm do farmakopealnych oznaczeń i ostrych pasm; 5 nm wystarcza do kolorymetrii.
- Próbki: mikroobjętości DNA/RNA – stanowisko nanoobjętościowe lub mikrokuwety; hodowle – uchwyt na probówki; kinetyka – termostat Peltiera i mieszadło.
- Oprogramowanie: krzywe wzorcowe, kinetyka, eksport, zgodność z wymaganiami systemu jakości (audit trail), język polski w szkole.
- Serwis i lampy: lampa deuterowa wytrzymuje ok. 1000–2000 h – sprawdź cenę i dostępność; wzorce do kontroli.
Najczęstsze pytania o spektrofotometry
Czym różni się spektrofotometr od kolorymetru?
Kolorymetr ma kilka filtrów lub diod o stałych długościach fali; spektrofotometr – monochromator, który pozwala wybrać dowolną długość fali i zarejestrować całe widmo.
Czy do pomiaru DNA mogę użyć kuwety plastikowej?
Zwykły polistyren pochłania UV poniżej ok. 340 nm, więc przy 260 nm nie nadaje się. Potrzebna jest kuweta kwarcowa albo specjalna „UV-przezroczysta” plastikowa (od ok. 220–230 nm) lub stanowisko mikroobjętościowe.
Dlaczego absorbancja powinna być między 0,1 a 1?
Poniżej 0,1 różnica między I₀ i I jest mała i szum detektora dominuje; powyżej 1 przez próbkę przechodzi mniej niż 10 % światła i rośnie udział światła rozproszonego, które zaniża wynik. W tym zakresie błąd względny stężenia jest najmniejszy.
Co oznacza stosunek A260/A280 = 1,6?
Zanieczyszczenie preparatu DNA białkiem lub fenolem (czyste DNA ≈ 1,8). Warto sprawdzić też A260/A230 (czyste ≈ 2,0–2,2; niższe – sole chaotropowe, EDTA, węglowodany).
Czy OD600 to absorbancja?
Formalnie nie – komórki rozpraszają światło, a nie pochłaniają. Przyrząd pokazuje „absorbancję”, ale wynik zależy od geometrii optyki danego modelu, dlatego OD600 porównuje się tylko w obrębie jednego urządzenia i po kalibracji na liczbę komórek.
Jak często wymieniać lampę deuterową?
Po ok. 1000–2000 h pracy albo gdy spada natężenie i rośnie szum w UV (przyrząd zwykle liczy godziny). Wyłączanie lampy UV, gdy mierzysz tylko w zakresie widzialnym, wydłuża jej życie.
Zobacz też: Sprzęt laboratoryjny – przewodnik A–Z · Pipety automatyczne – dokładne odmierzanie próbek · Wagi laboratoryjne – przygotowanie wzorców · Wyposażenie laboratorium – lista i konfigurator · Wycena wyposażenia laboratorium
Więcej o sprzęcie i wyposażeniu laboratorium: Sprzęt laboratoryjny – przewodnik A–Z →
