Od szkła do chipu, czyli jakie badania wykonuje się w laboratorium cytogenetycznym i kiedy warto je wykonać?
Klasyczne badania cytogenetyczne są stosowane w laboratoriach już od lat 60. XX wieku. Dzięki nim możliwa stała się analiza prążkowa chromosomów. Kolejne dekady przyniosły stopniowe wprowadzanie analiz DNA, które otworzyły nowe możliwości diagnostyczne, w tym zwiększenie ilości wykonywanych badań. Przykładem badania genetycznego na pograniczu cytogenetyki oraz genetyki molekularnej jest metoda porównywawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy, która pozwala identyfikować zmiany o wiele mniejszej wielkości niż w klasycznym badaniu kariotypu. Przełomowym osiągnięciem na początku XXI wieku było poznanie pełnej sekwencji ludzkiego genomu, dzięki czemu możliwe stało się lepsze rozumienie mechanizmów chorób, rozwój nowoczesnej diagnostyki oraz tworzenie spersonalizowanych metod leczenia. Należy wspomnieć, iż wykonywane w laboratorium badania genetyczne, w tym również cytogenetyczne mają ogromny wpływ na diagnostykę i leczenie nowotworów, jednak artykuł skupia się głównie na ich zastosowaniu w diagnostyce schorzeń nienowotworowych.
KARIOTYP
Badanie kariotypu wykonuje się wtedy, gdy podejrzewa się, że objawy kliniczne mogą mieć związek z obecnością ewentualnej aberracji chromosomowej, nawet jeśli fenotyp jest typowy dla znanego zespołu. Badanie to umożliwia również rozpoznanie nosicielstwa zrównoważonych translokacji chromosomowych u zdrowych rodziców, co pozwala wykryć pochodzenie zmiany u dziecka oraz określić ryzyko genetyczne. Nie ma uzasadnienia, aby stosować klasyczne badania cytogenetyczne rutynowo we wszystkich chorobach genetycznych, ponieważ większość z nich ma charakter wielogenowy lub jednogenowy – w takich przypadkach zalecane jest wykonanie innych badań genetycznych, o większej rozdzielczości.
Ryc.1. Trisomia chromosomu 13 pary będą wynikiem translokacji Robertsonowskiej (fuzji centrycznej) pomiędzy chromosomami 13 i 14 pary.
| Wskazania kliniczne | / Przykładowe uzasadnienie |
|---|
| Cechy fenotypowe zespołu chromosomowego, wady rozwojowe | Wady wrodzone, opóźnienie rozwoju fizycznego oraz umysłowego, cechy dysmorfii. |
| Nieprawidłowości miesiączkowania | Pierwotny lub wtórny brak miesiączki, nieprawidłowe cykle. |
| Znaczny niedobór wzrostu o nieznanej etiologii | Występujący u kobiet. |
| Niepowodzenia rozrodu | Problemy z zajściem w ciążę lub powtarzające się poronienia (minimum 2 w I trymestrze ciąży) |
| Nieprawidłowości w okresie dojrzewania | Brak rozwoju cech płciowych, nadmierny wzrost lub niski wzrost, nieprawidłowa budowa narządów płciowych. |
| Występowanie aberracji chromosomowej w rodzinie | Rodzice dzieci z aberracją chromosomową, potomstwo nosicieli zrównoważonej aberracji chromosomowej, rodzice i rodzeństwo nosicieli aberracji chromosomowej |
| Diagnostyka prenatalna | U kobiet w ciąży, w przypadku wyższego niż w populacji ryzyka urodzenia dziecka z aberracją chromosomową |
| Nowotwory hematologiczne | W celu wykrycia aberracji chromosomowych związanych z danym nowotworem. |
FLUOROSCENCYJNA HYBRYDYZACJA in situ – FISH
FISH pozwala na identyfikację duplikacji nieznanego pochodzenia, chromosomów markerowych, złożonych translokacji, czy aberracji danych regionów chromosomów Y i X. Dlatego metoda jest często używana w diagnostyce zaburzeń różnicowania płci, dysgenezji gonad, niepłodności oraz jako uzupełnienie do badania kariotypu. Poprzednio miała większe zastosowanie – między innymi do wykrywania niektórych mikrodelecji, jednak obecnie zaleca się wykonywać inne, dedykowane badania genetyczne, takie jak MLPA, czy aCGH. Technika FISH polega na identyfikacji regionów lub chromosomów poprzez powstanie kompleksu DNA chromosomowego oraz komplementarnej i specyficznej sondy molekularnej wyznakowanej fluorochromem.
Ryc.2. Badanie FISH. Zastosowano sondę specyficzną dla regionu 22q11.2 (sygnał czerwony) oraz 22q13.3 (sygnał zielony). Widoczna mikrodelecja regionu krytycznego dla zespołu mikrodelecji 22q11.2.
PORÓWNYWACZA HYBRYDYZACJA GENOMOWA DO MIKROMACIERZY (aCGH)
aCGH (ang. Array Comparative Genomic Hybridization) to rozwiązanie do analizy kariotypu o wysokiej rozdzielczości, służące do wykrywania zmian liczby kopii sekwencji DNA (CNV – ang. Copy Number Variations) w genomie. Niektóre macierze z sondami SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism) umożliwiają również wykryć utratę heterozygotyczności i disomię jednorodzicielską (UPD). Badanie aCGH znajduje szerokie zastosowanie w diagnostyce klinicznej. Umożliwia identyfikację m.in. przyczyn zaburzeń rozwoju, opóźnienia psychoruchowego, autyzmu oraz niepełnosprawności intelektualnej, dostarczając istotnych informacji genetycznych u pacjentów pediatrycznych. Jest także pomocne w ustalaniu przyczyn wad wrodzonych i zespołów dysmorficznych, gdzie zmiany w liczbie kopii DNA mogą odgrywać kluczową rolę. W badaniach prenatalnych mają również zastosowanie – szczególnie gdy wynik kariotypu jest prawidłowy, a w badaniu USG zidentyfikowano nieprawidłowości.
Ryc.3. Możliwości i ograniczenia badania aCGH. Gwiazdka odnosi się do zastosowania specjalnych mikromacierzy z sondami SNP.
Analiza wyniku i interpretacja znaczenia klinicznego zmian zidentyfikowanych w badaniu aCGH opiera się na uwzględnieniu informacji zawartych w różnych genetycznych bazach danych, takich jak: Franklin, DGV, ClinVar, DECIPHER, OMIM, Orphanet oraz w publikacjach naukowych. Klasyfikacja wariantów w diagnostyce postnatalnej to: patogenny, prawdopodobnie patogenny, o nieznanym znaczeniu klinicznym, łagodny i prawdopodobnie łagodny. Opracowanie wyniku badania prenatalnego aCGH nieco się różni – według zaleceń Europejskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka podaje się jedynie informacje o aberracjach, które są patogenne.
Zasada metody aCGH polega na znakowaniu DNA pacjenta oraz DNA kontrolnego różnymi fluorochromami, najczęściej w odmiennych barwach. Następnie przygotowane próbki DNA poddaje się hybrydyzacji do mikromacierzy, która zawiera sondy obejmujące cały genom. Po zakończeniu procesu specjalny skaner odczytuje intensywność sygnałów fluorescencji. W przypadku delecji w określonym regionie genomu sygnał przesuwa się w stronę koloru charakterystycznego dla próbki kontrolnej, natomiast w przypadku duplikacji – w stronę koloru odpowiadającego DNA pacjenta. Następnie pliki wygenerowane na komputerze podłączonym do skanera wgrywa się do dedykowanego programu do analizy, który określi parametry jakościowe próbki, a następnie rodzaj (duplikacja, delecja, w przypadku sond SNP również region utraty heterozygotycznościi), wielkość, zakres i lokalizację wykrytych zmian. Dalsza analiza, interpretacja i opracowanie wyniku należą do osoby pracującej w medycznym laboratorium diagnostycznym (diagnosta laboratoryjny, biotechnolog, biolog) w ścisłej współpracy z lekarzem genetykiem i z uwzględnieniem korelacji genotypowo-fenotypowej.
Ryc.4. Schemat przedstawiający w skrócie technikę aCGH.
Ryc.5. Przykładowy fragment obrazu z programu do analizy aCGH.
Choć cytogenetyczne badania postnatalne tradycyjnie kojarzone są przede wszystkim z analizą kariotypu, współcześnie częściej wykonuje się metodę o wyższej rozdzielczości – aCGH. Badania wykonywane przez wykwalifikowany personel w laboratorium cytogenetycznym stanowią kluczowy element współczesnej diagnostyki medycznej. Umożliwiają one wykrywanie zarówno dużych nieprawidłowości chromosomowych, jak i submikroskopowych zmian w genomie, które mogą mieć istotne znaczenie kliniczne. Dzięki zastosowaniu metod klasycznych, takich jak analiza kariotypu, oraz nowoczesnych technik na pograniczu cytogenetyki oraz genetyki molekularnej – FISH oraz aCGH możliwe jest precyzyjne rozpoznanie przyczyn wielu chorób wrodzonych, zaburzeń rozwoju, a także predyspozycji do niektórych nowotworów. Wyniki tych badań pozwalają nie tylko na postawienie trafnej diagnozy, ale również na określenie rokowania, dobór odpowiedniego postępowania terapeutycznego i właściwe poradnictwo genetyczne dla pacjenta i jego rodziny.
Autor: mgr Sylwia Purwin
