autor: mgr Mateusz Witkowski, diagnosta laboratoryjny
Wstęp
Aglutynacja mieszana (ang mixed – field agglutination , MFA) jest zjawiskiem obserwowanym w badaniach immunohematologicznych, szczególnie podczas oznaczania grupy krwi w układzie ABO. Część krwinek czerwonych reaguje z danym odczynnikiem anty-A lub anty-B, a część nie reaguje. Charakteryzuje się występowaniem dwóch populacji krwinek czerwonych, część z nich ulega aglutynacji a część pozostaje niezaglutynowana. W metodach mikrokolumnowych zaglutynowane krwinki czerwone tworzą zwartą linię na powierzchni żelu lub są rozproszone w górnej części żelu a niezaglutynowane krwinki czerwone są ciasno osadzone na dnie mikrokolumny. Obecność takiego obrazu wskazuje na przyczyny fizjologiczne, ale także nabyte przyczyny tzw. niezgodność serologiczną. Aglutynacja mieszana wymaga wyjaśnienia przed ustaleniem grupy krwi i doboru składników krwi do transfuzji.
Przyczyny występowania aglutynacji mieszanej
Typowe przyczyny występowania aglutynacji mieszanej przy oznaczaniu grupy krwi:
-transfuzja krwinek czerwonych o innym fenotypie niż fenotyp biorcy w ciągu ostatnich 3-4 miesięcy
– przeszczep komórek macierzystych o innym fenotypie krwinek czerwonych niż fenotyp biorcy
– masywny przeciek matczyno- płodowy
– zanieczyszczenie krwi pępowinowej przez krew matki
– słaba ekspresja antygenu (np. fenotyp A3)
– pasma fibryny (włóknika) zatrzymujące krwinki czerwone na powierzchni żelu (dotyczy IDsystem)
– obecność galarety Whartona (we krwi pępowinowej) zatrzymującej czerwone krwinki na powierzchni żelu (dotyczy ID-system)
– chimeryzm (różne fenotypy), w szczególności u bliźniąt dwujajowych
– utrata ekspresji antygenu z powodu choroby podstawowej (np. białaczki) tzw. depresja antygenu
– pacjenci z osłabioną ekspresją antygenu D w związku z chorobą mieloproliferacyjną
– pacjent RhD + (dodatni) po przetoczeniu KKCz RhD – ujemny
Typowe przyczyny występowania reakcji imitujących reakcje aglutynacji mieszanej w badaniu przeglądowym przeciwciał odpornościowych w PTA oraz badaniu przeciwciał grupowych:
– dodatnia reakcja z przeciwciałami o niskiej awidności
– dodatnia reakcja z przeciwciałami typu zimnego
– pasma fibryny (włóknika) zatrzymujące czerwone krwinki na powierzchni żelu
– silne zjawisko rulonizacji
– niektóre przeciwciała o swoistości anty-Lua lub anty-Sda mające tendencję do wykazywania reakcji aglutynacji mieszanej
– dodatnia reakcja z odczynnikiem czerwonokrwinkowym wykonanym z puli krwinek czerwonych pochodzących od różnych dawców ( niektóre krwinki mogą nie posiadać antygenu, do którego skierowane jest przeciwciało o danej swoistości)
– zaburzenia procesu zapłodnienia – dispermia- zjawisko trwałe
Charakterystyka poszczególnych przyczyn aglutynacji mieszanej
Niedawna transfuzja krwi
Jest jedną z najważniejszych przyczyn aglutynacji mieszanej. Przyczyną obecności dwóch populacji krwinek czerwonych może być przetoczenie krwinek grupy O osobie z grupą krwi A,B lub AB. Jest kilka sytuacji, w których pacjentowi dobieramy KKCz grupy 0:
– pilna transfuzja i sytuacja ratująca życie pacjenta (wstrząs krwotoczny, ciężkie wypadki, gdy lekarz decyduje się na przetoczenie przed wykonaniem badania grupy krwi i próby zgodności serologicznej)
– w przypadku braku krwi jednoimiennej w Banku Krwi, również dla szczególnych biorców krwi, którzy wytworzyli przeciwciała odpornościowe
– w przypadku trudności w oznaczeniu grupy krwi z przyczyn laboratoryjnych i chorobowych
– w przypadku słabej ekspresji antygenu A lub B, trudności z określeniem ABO biorcy
– brak krwi Rh D ujemnej jednoimiennej w układzie ABO
– w przypadku konfliktu serologicznego u noworodka , dzieciom z grupą krwi A lub B urodzonym przez matki grupy O
Obecność krwinek dawcy może utrzymywać się w krążeniu przez pewien czas i powodować niejednoznaczny wynik grupy krwi. Zjawisko aglutynacji mieszanej może pojawić się również w przypadku masywnej transfuzji, gdy krwinki dawcy stanowią znaczną część krążącej populacji. Masywnym przetoczeniem określa się przetoczenie krwi w ciągu 24 godzin objętości krwi, równej objętości krwi pacjenta. W przypadku osób dorosłych jest to od 8-10 jednostek KKCz, a w przypadku dzieci 80-100 ml/kg masy ciała. W odniesieniu do pilnej transfuzji, kiedy nieznana jest grupa krwi ABO i RhD pacjenta wydaje się KKCz grupy O Rh D ujemny i decyzja taka jest podejmowana za każdym razem indywidualnie w porozumieniu z lekarzem wystawiającym zlecenie.
Słabe odmiany antygenów układu ABO
Za obecnością słabych odmian antygenów A lub B przemawia:
– znaczne osłabienie lub brak aglutynacji badanych krwinek z odczynnikiem diagnostycznym anty-A lub/i anty-B przy często obserwowanym braku oczekiwanych aglutynin
-obraz dwóch populacji badanych krwinek z odczynnikami diagnostycznymi
Wśród osób z grupą krwi A można wykryć odmiany antygenu oznaczane jako : A2,A3,Ax,Am,Ael,Aend, które posiadają odpowiednio coraz mniej determinant antygenu A: od ok. 1 miliona w A1 do 500 tys. w A2, 100 tys w A3, czy ok. 100 w Aend. U osób z grupą krwi B rzadziej wykrywa się słabe odmiany niż w grupie A i są to : B3,Bx,Bm,Bel. We wszystkich przypadkach różnice na poziomie genetycznym są związane z polimorfizmem pojedynczych nukleotydów w odpowiednich alllelach w genie ABO.
Tabela 1 Zestawienie najbardziej typowych reakcji rzadkich odmian antygenów układu ABO
| Fenotyp | Reakcja krwinek z odczynnikami diagnostycznymi | Reakcje surowicy z krwinkami wzorcowymi | ||||||
| anty-A | anty-B | antyA1B | anty-H | A1 | A2 | B | 0 | |
| A3 | Aglutynacja mieszana | 0 | Aglutynacja mieszana | 3+ | +/- | 0 | 3+ | 0 |
| Am | 0/+- | 0 | 0/+- | 4+ | 0 | 0 | 4+ | 0 |
| Ax | 0/+- | 0 | 1+/2+ | 4+ | 1+ | 0 | 4+ | 0 |
| Ael | 0 | 0 | 0 | 4+ | 2+ | 0 | 4+ | 0 |
| Aend | +sł | 0 | +sł | 4+ | 0 | 0 | 3+ | 0 |
| B3 | 0 | Aglutynacja mieszana | Aglutynacja mieszana | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | 0 |
| Bm | 0 | 0 | 0 | 0/+/- | 4+ | 3+ | 0 | 0 |
| Bx | 0 | 0/+- | 0/2+ | 4+ | 4+ | 3+ | 0 | 0 |
| Bend | 0 | +sł | +sł | 4+ | 3+ | 3+ | 0 | 0 |
Depresja antygenów w układzie ABO
Ekspresja antygenów A i B może ulec osłabieniu podczas translokacji w chromosomie 9, które są związane z białaczką szpikową oraz podczas innych zaburzeń w hematopoezie, na przykład w talasemii, w niedokrwistości Diamonda Blackfana, w erytroleukemii. Dochodzi wówczas do modyfikacji łańcuchów cukrowych i zmian ekspresji oprócz antygenów A i B również H oraz I. Osoba z grupą krwi AB może mieć wówczas grupę krwi 0 lub podwójną populację krwinek czerwonych AB, A, B i O. W remisji zmiany te ustępują i pojawia się pierwotna grupa krwi. Sytuacje takie opisuje się najczęściej w :
– ostrej białaczce szpikowej (AML)
-zespołach mielodysplastycznych (MDS)
-niektórych innych nowotworach hematologicznych
Przeszczepianie krwiotwórczych komórek macierzystych
Jest często jedyną szansą na wyleczenie pacjentów z niektórymi chorobami hematologicznymi i i
i immunologicznymi. Źródłem krwiotwórczych komórek macierzystych są szpik, krew obwodowa, krew pępowinowa.
Najczęstszymi wskazaniami do przeszczepienia są:
– nabyte choroby hematologiczne: ostra białaczka szpikowa, ostra białaczka limfoblastyczna, przewlekła białaczka szpikowa, chłoniaki nieziarnicze, szpiczak mnogi, zespół mielodysplastyczny, aplazja szpiku
– wrodzone defekty komórki macierzystej krwi : ciężki wrodzony zespół braku odporności, talasemie, hemoglobinopatie
Z uwagi na ograniczoną liczbę dawców przeszczepów allogenicznych i trudności w doborze osób zgodnych a HLA, niezgodność w antygenach grupowych i obecność alloprzeciwciał skierowanych do antygenów krwinek czerwonych nie są przeciwwskazaniem do wykonania transplantacji. Nabyty antygen A lub B może pojawić na przetoczonych krwinkach czerwonych grupy 0, jeżeli pacjent ma grupę A lub B, albo jest biorcą krwiotwórczych komórek w tzw. małej niezgodności z dawcą.
Tabela 2 Rodzaje niezgodności w układzie ABO podczas przeszczepiania komórek krwiotwórczych
| Rodzaje niezgodności | Grupa Krwi | |
| Biorca | Dawca | |
| duża | O | A, B, AB |
| A | AB | |
| B | AB | |
| mała | AB | O,A,B |
| A | O | |
| B | O | |
| Duża i mała | A | B |
| B | A | |
Niezgodność duża skutkuje pojawieniem się po kilku tygodniach, czasami kilku miesiącach krwinek czerwonych z antygenem dawcy oraz obniżeniem się miana przeciwciał aż do zupełnego ich zaniku.
Niezgodność mała skutkuje stopniowym zanikiem krwinek z antygenem biorcy, natomiast przeciwciała pozostają niewykrywalne.
Omówione powyżej sytuacje związane z przeszczepianiem krwiotwórczych komórek macierzystych sprawiają, że w okresie serokonwersji mogą występować dwie populacje krwinek czerwonych.
Chimeryzm naturalny bliżniaczy, tetragenetyczny
Chimeryzm oznacza obecność w jednym organizmie dwóch genetycznie różnych populacji komórek, które powstały z różnych zygot. Może mieć znaczenie w transfuzjologii, ponieważ dwie populacje erytrocytów mogą różnić się antygenami grup krwi i powodować aglutynację mieszaną.
Chimeryzm naturalny bliźniaczy występuje przede wszystkim u bliźniąt dwuzygotycznych, które mają wspólne połączenie naczyń w łożysku. W życiu płodowym może dochodzić do wzajemnego przenikania komórek krwiotwórczych między płodami. W efekcie po urodzeniu jedno dziecko może mieć w krążeniu:
-własne erytrocyty
-niewielką populację erytrocytów pochodzących od bliźniaka
Jeśli bliźnięta mają różne grupy krwi np. A i 0 u jednego z nich mogą występować jednocześnie krwinki A i 0.
Chimeryzm tetragenetyczny jest bardzo rzadkim zjawiskiem. Powstaje, gdy dochodzi do połączenia dwóch różnych zygot, które powstały z czterech gamet. Powstały organizm posiada dwie różne linie komórkowe o odmiennym materiale genetycznym. Jeśli obie linie różnią się pod względem grup ABO, mogą powstać dwie populacje erytrocytów i dawać obraz aglutynacji mieszanej.
Transfuzje u noworodków
W doborze krwi do transfuzji w neonatologii należy uwzględnić konflikt serologiczny w zakresie antygenów z układu ABO, antygenu D z układu Rh i innych antygenów czerwonokrwinkowych. Konflikt między matką i dzieckiem w zakresie antygenów układu ABO dotyczy 15% ciąż i występuje najczęściej w sytuacji gdy matka ma grupę krwi 0, a dziecko grupę krwi A. W takim przypadku w razie konieczności transfuzji krwi u noworodka dobieramy NUKKCz grupy 0, RhD zgodnym z dzieckiem, bez antygenu K. W trakcie wykonywania w późniejszym czasie badań immunohemtologicznych np. w diagnostyce ChHPN mogą występować nieoczekiwane reakcje hematologiczne, w tym aglutynacja mieszana po transfuzjach dopłodowych NUKKCz grupy OrhD ujemny. W takim przypadku nie należy wydawać grupy krwi noworodka oraz należy potwierdzić informacje o transfuzjach w postaci wywiadu transfuzjologicznego i w dokumentacji ciąży.
Diagnostyka laboratoryjna aglutynacji mieszanej
W przypadku stwierdzenia aglutynacji mieszanej należy przede wszystkim zweryfikować wynik i zebrać dokładny wywiad transfuzjologiczny.
Podstawowe postępowanie obejmuje:
– powtórzenie oznaczenia grupy ABO i RhD
– sprawdzenie wcześniejszych wyników grupy krwi
– ustalenie czy pacjent miał w przeciągu ostatnich 3 miesięcy transfuzję krwi
– ocene historii transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych
– wykonanie badania na innych metodach serologicznych, jeśli jest to konieczne
– ocenę podgrup ABO
-wykonanie dodatkowych badań immunohematologicznych
– w wybranych przypadkach zastosowanie cytometrii przepływowej lub badań molekularnych
Szczególne znaczenie przed transfuzją
Reakcja aglutynacji mieszanej nabiera szczególnego znaczenia, gdy pacjent wymaga pilnego przetoczenia. Niejasny wynik grupy krwi nie powinien być traktowany jako niedogodność techniczna. Właściwe ustalenie grupy krwi jest jednym z podstawowych elementów bezpiecznej transfuzji. W przypadku rozbieżności diagnostycznej laboratorium transfuzjologiczne powinno ustalić jej przyczynę i postępować zgodnie z obowiązującymi procedurami oraz zasadami bezpieczeństwa transfuzjologicznego. Szczególnie istotne jest uwzględnienie niedawnych transfuzji krwi. Krwinki dawcy mogą być obecne w krążeniu pacjenta przez pewien czas i wpływać na wyniki badań serologicznych. W przypadku bardzo pilnego przetoczenia i trudności w oznaczeniu grupy krwi poprzez istnienie silnej aglutynacji mieszanej należy:
– dobierać KKCz grupy O , w przypadku kobiet przed menopauzą KKCz grupy O RhD ujemny K-
-dobierać osocze i krioprecypitat grupy AB
-dobierać KKP rekonstytuowany (płytki grupy 0 w osoczu AB) lub AB jeśli rekonstytuowany jest niedostępny
Podsumowanie
Podwójna populacja krwinek czerwonych nie jest chorobą ani ostatecznym rozpoznaniem. Jest sygnałem diagnostycznym wskazującym na współistnienie dwóch populacji krwinek różniących się reakcją z danym odczynnikiem. W immunologii transfuzjologicznej każda rozbieżność ma znaczenie. Za pozornie niewielką różnicą w obrazie aglutynacji może kryć się ważna informacja w przeszłości serologicznej pacjenta. Podwójna populacja nie jest problemem który należy pominąć, ale wskazówką którą należy prawidłowo odczytać.
Bibliografia
1.Fabijańska-Mitek J.,Bochenek-Jantczak D.,Grajewska A.,Badania immunohematologiczne w transfuzjologii-kompendium, Pro Pharmacia Futura, Warszawa 2023.
2.Fabijańska-Mitek J.,Immunohematologia Grupy krwi i niedokrwistości, Pro Pharmacia Futura, Warszawa 2018.
3.Korsak J., Łętowska M., Transfuzjologia kliniczna,α- Medica Press, Warszawa 2009.
4.Obwieszczenie Ministra Zdrowia z dnia 9 czerwca 2017r. W sprawie wymagań dobrej praktyki pobierania krwi i jej składników, badania, preparatyki, wydawania i transportu dla jednostek organizacyjnych publicznej służby krwi.
5.Shastry S., Murugesan M.. Bhat S., Mixed field agglutination: Unusual causes and serological approach, Asian Journal of Transfusion Science 2014
6. Narayanan G., Blood group change in acute myeloid leukemia. Baylor University Medical Center Proceedings 2017.
7.Anykul N., Leetrakool N.,Tanan P.,Palacajornsuk P.,Klanginsirikul P. , Mixed-field agglutination observed in column agglutination testing is not always associated with the A3 subgroup. Immunohematology 2018.
