Techniki oznaczania antygenów układu AB0 oraz antygenu D z układu Rh

W celu oznaczenia antygenów i alloprzeciwciał układu AB0 oraz antygenu D z układu Rh stosujemy wybrane techniki :

• szkiełkową,
• probówkową,
• kolumnową (ręczną lub automatyczną).

Przed przystąpieniem do badań serologicznych należy wykonać kontrolę swoistości i aktywności zestawu odczynników monoklonalnych i krwinek wzorcowych. W pracowni immunologii transfuzjologicznej codziennie sprawdza się także karty stosowane do techniki mikrokolumnowej oraz mikropłytki, które należy poddać kwalifikacji przed pierwszym dopuszczeniem do badań.

Kontrolę swoistości i aktywności zestawu do oznaczania grup krwi układu AB0 i antygenu D z układu Rh przeprowadza się z zastosowaniem tzw. krwi kontrolnej. Jest to odczynnik gotowy do użycia, uzyskany z wyselekcjonowanych dawców krwi. W jego skład wchodzą dwie probówki krwi  zawierające krwinki i osocze, dobrane tak, aby dawały możliwość sprawdzenia zarówno reakcji dodatnich jak i ujemnych:

• odczynników monoklonalnych do oznaczania antygenów układu AB0 i antygenu D z układu Rh,
• krwinek wzorcowych do badania regularnych przeciwciał z układu AB0.

Jedna próbka jest RhD dodatnia, a druga RhD ujemna, natomiast w zakresie AB0 może być krew grup A i B oraz 0 i AB.

Oznaczenie antygenów układu AB0 i naturalnych alloprzeciwciał

Antygeny układu AB0 określamy na podstawie obecności lub braku aglutynacji odczynników monoklonalnych z krwinkami badanymi pacjenta. Zarówno u biorców jak i u dawców badanie wykonuje się z zastosowaniem dwóch zestawów odczynników monoklonalnych anty – A i anty – B, które pochodzą z dwóch różnych klonów lub z jednego klonu, ale wówczas muszą różnić się numerem serii. W badaniach wykonywanych metodą automatyczną dopuszcza się stosowanie tylko jednego zestawu odczynników anty – A i anty -B, pod warunkiem, że w próbce badanej następuje jednoczesne oznaczenie regularnych przeciwciał anty – A i anty – B.

Odczynniki monoklonalne do oznaczania grup krwi AB0 zawierają mysie przeciwciała monoklonalne IgM, rozcieńczone w odpowiednim roztworze zależnym od producenta. Każdy odczynnik jest dostarczany w optymalnym stężeniu do użytku we wszystkich zalecanych metodach badania bez konieczności dalszego rozcieńczania i dodawania jakichkolwiek substancji. Odczynniki powodują bezpośrednią aglutynacje badanych krwinek czerwonych, które zawierają odpowiedni antygen układu AB0. Brak aglutynacji wskazuje zazwyczaj na nieobecność antygenu AB0 (grupa 0).

Do oznaczenia regularnych przeciwciał układu AB0 stosuje się krwinki wzorcowe grup 0, A₁ , B. Wówczas bada się osocze lub surowicę pacjenta z krwinkami wzorcowymi, a aglutynacja badanego osocza z krwinkami wzorcowymi świadczy o obecności przeciwciał. W przypadku metod automatycznych przepisy dopuszczają pominięcie krwinek wzorcowych grupy 0 przy oznaczeniu przeciwciał układu AB0.

Oznaczenie antygenu D z układu Rh

Antygen D określa się na podstawie obecności lub braku aglutynacji krwinek czerwonych z odczynnikiem monoklonalnym anty – D. Do oznaczenia należy stosować dwie różne serie odczynników pochodzących z dwóch różnych klonów:

• odczynnika monoklonalnego anty – D IgM (klon RUM – 1),
• odczynnika monoklonalnego anty – D pochodzącego z innego klonu lub anty – D IgM + IgG (Blend – mieszanina przeciwciał IgM + IgG). Odczynnik anty – D Blend wykrywa krwinki z częściową odmianą antygenu D w tym z antygenem D kategorii VI (D^VI).

W badaniu antygenów D u biorców krwi i kobiet w ciąży przynajmniej jeden z odczynników nie może reagować z kategorią D^VI krwinek czerwonych. Badani pacjenci są określani wówczas jako RhD ujemni, a kobiety w ciąży zakwalifikowane do profilaktyki przy zastosowaniu immunoglobuliny anty – RhD.

Odczynniki anty-D do badania antygenu D u noworodka w badaniu kwalifikacyjnym do podania RhD ujemnej matce immunoglobuliny anty-RhD powinny być tak dobrane, aby przynajmniej jeden z nich wykrywał słabej odmiany antygenu D.

Badania antygenu D należy wykonywać wyłącznie w teście bezpośredniej aglutynacji. Oznaczanie antygenu D pośrednim testem antyglobulinowym (PTA) stwarza ryzyko uzyskania fałszywie dodatniego wyniku, jeśli bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) u pacjenta jest dodatni.

W przypadku każdego pierwszorazowego dawcy krwi, badanie antygenu D wykonuje się stosując dwa różne odczynniki anty – D. Powinny one wykrywać antygen D o słabej ekspresji w tym D^VI. Do diagnostyki słabych odmian u dawców można dodatkowo zastosować PTA lub metodę biologii molekularnej i badanie genu.

Technika kolumnowa ręczna i automatyczna

Technika kolumnowa jest jedną z najbardziej czułych i swoistych metod do oznaczania grup krwi. Ze względu na swoją czułość jest szczególnie zalecana w badaniach grup krwi u noworodków i niemowląt. Podstawę badania stanowią mikroprobówki z żelem zawierającym monoklonalne lub poliklonalne (ludzkie) odczynniki anty – A, anty -B oraz anty – D. Sposób wykonania badania jest różny w zależności od wybranej techniki kolumnowej i zastosowanej karty. Postępowanie jest wówczas ściśle określone przez producenta testów.

Materiał do badań stanowi prawidłowo opisana krew żylna pobrana na „EDTA”, z której po odwirowaniu zostaje sporządzona zawiesina krwinek w roztworze określonym przez producenta.

W technice kolumnowej manualnej badanie wykonuje się dodając do kolejnych mikroprobówek zalecaną przez producenta objętość zawiesin poszczególnych krwinek badanych oraz krwinek wzorcowych A₁ i B, do których dodaje się następnie określoną objętość badanego osocza. Karty wiruje się przy użyciu firmowych wirówek, a wyniki odczytuje się makroskopowo i zapisuje w księgach.

W przypadku metod automatycznych, w zależności od producenta używa się firmowych mikrokart. Całe badanie wykonywane jest w analizatorze, a wynik przesyłany do systemu informatycznego, gdzie następuje weryfikacja wyniku przez uprawniononego diagnostę laboratoryjnego.

Technika probówkowa

W przypadku techniki probówkowej materiał do badań stanowi także prawidłowo opisana krew żylna pobrana na „EDTA”. Z uprzednio odwirowanej próbki krwi pacjenta należy wykonać 3 – 4%  zawiesinę krwinek czerwonych w roztworze PBS lub w surowicy autologicznej.

W celu oznaczenia antygenów z układu AB0 stosujemy dwa odczynniki monoklonalne anty – A (różniące się klonem lub numerem serii) oraz dwa odczynniki monoklonalne anty – B (różniące się klonem lub numerem serii).

Antygen D oznaczamy za pomocą dwóch odczynników monoklonalnych anty – D ( RUM i Blend).

Regularne przeciwciała anty – A i anty – B wykrywamy za pomocą zestawu krwinek wzorcowych 0, A₁, B (mogą to być krwinki gotowe do użycia bądź zawieszone w płynie konserwującym i wymagające przygotowania).

Badanie wykonuje się w przeźroczystych probówkach, które należy uprzednio opisać numerem badania, a także oznaczyć nazwą odczynnika monoklonalnego i krwinek wzorcowych.

Schemat postępowania:

• do odpowiednio opisanych probówek dodać po 1 – 2 krople odczynników monoklonalnych anty – A1, anty – B1, anty – A2, anty – B2, anty – D1 i anty – D2;
• do odpowiednio opisanych probówek (3 probówki) dodać po 1 – 2 krople surowicy badanej;
• do probówek z odczynnikiem monoklonalnym dodać po 1 – 2 krople, 3 – 4% zawiesiny krwinek badanych;
• do probówek z surowicą badaną dodać po 1 – 2 krople zawiesiny krwinek wzorcowych 0, A₁, B;
• próbówki należy inkubować 3 – 5 min w temperaturze pokojowej;
• po okresie inkubacji odwirować probówki z zachowaniem ustalonych parametrów;
• odczytać i zaprotokołować wynik reakcji.

Ryc. 1 Schemat postępowania przy określaniu grupy krwi metodą probówkową.

Technika szkiełkowa

W przypadku zastosowania techniki szkiełkowej materiał do badań stanowi tak samo jak powyżej prawidłowo opisana krew żylna pobrana na „EDTA”. Jednak w przypadku tej techniki, z uprzednio odwirowanej próbki należy sporządzić 5 – 10% zawiesinę krwinek czerwonych w roztworze PBS lub surowicy autologicznej. Badanie wykonywane jest na specjalnych płytach zawierających dołki do badan.

Schemat postępowania:

• na opisaną płytę nanieść po 1 – 2 krople odczynników monoklonalnych anty – A1, anty – B1, anty – A2, anty – B2, anty – D1 i anty – D2;
• w odpowiednio opisane dołki na płycie dodać po 1 – 2 krople surowicy badanej;
• do odczynników monoklonalnych dodać 1 – 2 krople 5 – 10% zawiesiny krwinek czerwonych;
• do surowicy badanej dodać 1 – 2 krople krwinek wzorcowych 0, A₁, B;
• odczynniki wymieszać z krwinkami kołysząc płytę lub używając bagietek;
• płytę pozostawić  od 3 – 5 min w temperaturze pokojowej;
• odczytać reakcję poruszając płytę ruchem okrężnym i wyniki zaprotokołować.

Według aktualnych wytycznych nie zaleca się wykonywania badań techniką szkiełkową, ze względu na ryzyko błędów wynikających z zanieczyszczenia pola reakcji oraz zbyt niską czułość w wykrywaniu u pacjentów antygenu D słaby typu 1, typu 2 lub typu 3.

Należy pamiętać, że wszystkie używane do badań probówki, płyty oraz mikrokarty w technice kolumnowej manualnej należy opisać numerem badanej próbki. W przypadku metod automatycznych zazwyczaj posługujemy się numerem kodu, a analizator sam nadaje badaniom kolejny numer badania. Wszystkie wyniki badania grupy krwi układu AB0 i antygenu D są protokołowane w odpowiednich książkach serologicznych lub ich dokumentacja jest prowadzona w formie wydruków elektronicznych.

 W przypadku badań wykonywanych manualnie wynik grupy krwi muszą odczytywać dwie osoby – jedna podaje uzyskane reakcje, a druga zapisuje je w książce za pomocą symboli + (aglutynacja) i – (brak aglutynacji). Następnie zamieniają się rolami i wzajemnie sprawdzają zgodność odczytu i zapisu w książce. Dodatkowo ocenia się stopień nasilenia aglutynacji od 1+ do 4+ co pozwala na określenie ewentualnych odstępstw od schematu. Zastosowanie technik automatycznych umożliwia odczyt przez jedną osobę.

Wynik grupy krwi układu AB0 musi być zgodny z regułą Landstainera, a aglutynacja odczynników monoklonalnych i badanych krwinek oscylować w zakresie od 2+ do 4+. W przypadku badanej surowicy z krwinkami wzorcowymi od 1+ do 4+. W celu prawidłowej interpretacji wyniku warto zapoznać się z  wywiadem serologicznym pacjenta.

Interpretacja antygenu D jest uzależniona od zastosowanej metody i stopnia nasilenia reakcji. Wyraźna aglutynacja z dwoma odczynnikami określona na co najmniej 2+ w technice szkiełkowej oraz 3+ w technice probówkowej i kolumnowej pozwala zaliczyć biorcę i  dawcę do grupy RhD dodatniej. Brak aglutynacji krwinek z dwoma odczynnikami anty – D określa daną osobę jako RhD ujemną. Aglutynacja o mniejszym nasileniu niż 2+ w technice szkiełkowej i mniejszym niż 3+ w technice probówkowej i kolumnowej świadczy o słabej odmianie antygenu D. Jeśli oznaczamy antygen D u pacjenta zalicza się do go grupy RhD ujemnej,  a wynik powinien brzmieć: RhD ujemny (słaba ekspresja antygenu D). W przypadku uzyskania słabych reakcji u dawcy krwi jest on określany jako RhD dodatni, w wynik powinien zawierać sformułowani: RhD dodatni (słaba ekspresja antygenu D), jako biorca RhD ujemny.

Autor: mgr Magdalena Zdral, diagnosta laboratoryjny

Bibliografia:

1. Badania immunohematologiczne i organizacja krwiolecznictwa – kompendium; Fabijańska-Mitek J., Bochenek-Jantczak D., Grajewska A., Wieczorek K.; wyd. Fundacja Pro Farmacja Futura; 2017
2. OBWIESZCZENIE MINISTRA ZDROWIA z dnia 11 stycznia 2023 r. w sprawie wymagań dobrej praktyki przechowywania i wydawania krwi i jej składników dla banków krwi oraz badań z zakresu immunologii transfuzjologicznej wykonywanych w zakładach leczniczych innych niż regionalne centra, Wojskowe Centrum lub Centrum MSWiA.
3. Immunologia krwinek czerwonych Pracownia serologii transfuzjologicznej, organizacja i metodyka badań; Wieczorek K., Bochenek-Jantczak K., Grajewska A.; wyd. Fundacja Pro Farmacja Futura; 2011
4. Serologia grup krwi w praktyce; Grzywak-Kołodziejczyk T., Wieczorek., Bochenek-Jantczak K., Grajewska A., Kozarska-Samek E.; wyd. na zlecenie RCKiK w Katowicach; 2007
5. Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi;praca zbiorowa pod redakcją Magdaleny Łętowskiej; Wydanie III; Instytut Hematologii i Transfuzjologii; Warszawa 2014